HIF-1α 在卵巢癌中的表达及与化疗耐药相关性研究

目的:探讨缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)在卵巢癌中的表达及其在卵巢癌化疗耐药中的作用。方法:采用免疫组化方法,检测96例卵巢癌组织,45例良性卵巢肿瘤和30例正常卵巢组织中HIF-1α的表达,分析其表达与临床病理特征及化疗耐药的相关性。结果:卵巢癌中HIF-1α的表达高于正常卵巢及良性卵巢肿瘤组织,且临床分期越晚其表达越高(P<0.001),而与肿瘤组织类型、病理分级及患者年龄无显著相关性。HIF-1α在卵巢癌化疗耐药组阳性率明显高于化疗敏感组(P<0.001)。结论:卵巢癌中HIF-1α高表达与卵巢癌的发生、发展、浸润和转移有关,与卵巢癌化疗耐药密切相关,HIF-1α可成为卵巢癌化疗新的分子治疗靶点。     

国内酿酒酵母分子遗传与育种研究40年

酿酒酵母作为最简单的真核生物,是研究真核生物基本生命规律的重要模式系统,也是生物产业领域非常重要的微生物细胞工厂。在《微生物学通报》创刊40周年之际,本文综述了国内40年来在酿酒酵母分子遗传学与育种研究的重要进展,如分子遗传学研究手段的建立、重要功能基因的分析、重要生命过程的遗传基础和调控机制,以及酵母菌育种技术的建立与应用等。     

D-核糖生产菌的选育

将枯草芽胞杆菌通过紫外线诱变得到了莽草酸缺陷突变株,在２８株突变株中有１０株积累Ｄ－核糖。这些菌株均属戊糖磷酸途径的非氧化支路缺失突变株。对这些菌株的产核糖能力进行了验证、培养基中芳香族氨基酸的浓度影响Ｄ－核糖的积累     

FLO1基因内重复序列对酿酒酵母絮凝能力及稳定性的影响

[目的]了解絮凝基因FLO1中重复DNA序列A对酵母菌絮凝能力及其遗传稳定性的影响,为构建遗传性能稳定、工业应用前景优良的最小絮凝功能基因奠定理论基础.[方法]通过融合PCR方法构建了FLO1中全部重复DNA序列A发生缺失的衍生基因FLO1a,以含有FLO1基因的大肠杆菌为筛选模型,通过连续传代培养及质粒快速分析获得FLO1内重复DNA序列A不同程度、不同位点缺失的系列衍生基因FLO1a1 -FL01a5.完整FLO1基因和上述衍生基因转化非絮凝型酵母YS58,得到重组菌株YSF1、YSF1a及YSF1a1 -YSF1a5,分析了上述不同酵母菌株絮凝特性及其遗传稳定性.[结果]絮凝基因FLO1中重复DNA序列A完全缺失使酵母细胞完全失去絮凝能力,部分重复DNA序列A发生缺失导致絮凝能力降低,絮凝基因中重复DNA序列A的个数与细胞絮凝能力成正相关,但不是简单的比例关系.其中衍生基因FLO1a3含有的重复DNA序列A是FLO1基因的33.3％,但菌株YSF1 a3的絮凝能力可达YSF1絮凝能力的71.4％.而且菌株YSF1 a3的絮凝特性比菌株YSF1的絮凝特性具有更好的环境适应性和遗传稳定性.[结论]重复DNA序列A是絮凝基因中非常活跃的序列,是导致絮凝特性遗传不稳定的关键因素,该序列的部分缺失不但可以使酵母细胞呈现适度的絮凝能力,而且使絮凝特性具有更好的环境适应性和遗传稳定性.该研究为通过对絮凝基因内衔接重复序列的合理调控,促进酵母絮凝特性在发酵工业及其他生物化工过程和环境修复中的广泛应用提供了重要的理论依据和解决策略.     

絮凝基因(FLOIG)的序列测定及分析

虽然酵母细胞絮凝的确切机制至今尚无定论,但已克隆了多个与絮凝相关的基因,如FLOI、FLO5、FLO11等[1-3].这些基因的表达可以赋予非絮凝酵母细胞以絮凝能力.酵母细胞的絮凝特性在酿造工业、固定化酶、精细化工和物生制药等领域具有广泛的应用价值[4,5].从一株强絮凝酿酒酵母菌株中克隆到一个约4.3kb的NDA片段,酵母转化实验证明该DNA片段能够赋予非絮凝酵母菌株以絮凝能力[6].本文简要报道对该DNA片段进行序列测定和分析的结果.     

pH值对D-核糖发酵的影响及补料发酵的研究

研究了不同 pH值对D 核糖产量的影响。发酵初期pH自然下降时有利于菌体生长 ,菌体生长对数期较长 ,菌体质量浓度最高可达 15 .3g/L ;发酵中后期 pH值控制在 7.0时有利于D 核糖的持续合成 ,同时对D -核糖的流加补料发酵进行了初步研究 ,最终使菌体质量浓度最高达到 2 0 .1g/L ,D 核糖产量达到了 6 2 .5g/L。     

酒类酒球菌mleP基因的克隆及其在酿酒酵母中的表达

苹果酸通透酶具有协助苹果酸 乳酸发酵 (MLF)的重要功能。以酒类酒球菌 (Oenococcusoeni)优良菌系Oenococcus Lee SD 2a的总DNA为模板 ,用PCR方法克隆到苹果酸通透酶基因mleP ,构建了重组质粒pBMmleP。序列分析表明克隆到的基因序列与已报道的序列同源性为 99%。为使目的基因在酿酒酵母中表达 ,以大肠杆菌 酿酒酵母穿梭质粒YEp35 2为载体 ,以PGK1强启动子和ADH1终止子为调控元件 ,构建了重组表达质粒YEpmleP ,并转化酿酒酵母 (Saccharomycescerevisiae)YS5 8。酵母转化子用含有亮氨酸、组氨酸和色氨酸的YNB平板筛选鉴定。获得的转化子在添加了L 苹果酸 (5g L)的培养基中培养 4d ;取培养液上清用HPLC检测 ,结果显示重组转化子YSP的培养液中L 苹果酸剩余含量均低于空载体转化子YS35 2 ,因此所得酵母重组转化子对苹果酸的转运能力有所提高     

红曲霉发酵液中桔霉素快速检测方法的优化

研究确立了一种高效液相色谱法,能有效地对红曲霉代谢产物中的桔霉素分离和定量分析。色谱柱:Shimadzu VP-ODS C18(5μm,250 mm×4.6 mm),流动相组成为V(乙腈):V(甲醇):V(水)=70:10:20,pH≤2.8。荧光检测器:λex=331 nm,λem=500 nm。在优化的色谱条件下绘制标准曲线,当桔霉素质量浓度为0.1 mg.L-1~1 mg.L-1时线性关系良好,R2=0.9992。对桔霉素标品的最低检测质量浓度为0.01 mg.L-1,在红曲霉发酵样品中的定量回收率达到了0.9187722~1.029138。     

人乳头瘤病毒16亚型L1蛋白在多形汉逊酵母中的优化表达

为了实现人乳头瘤病毒(Humanpa pillomavirus,HPV)16亚型衣壳蛋白L1在多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)中的高效表达,根据L1蛋白的氨基酸序列及多形汉逊酵母的密码子偏爱性,对L1蛋白的编码序列进行优化设计,合成了完整的编码序列,命名为HPV16L1。以甲醇诱导型启动子MOXp和终止子AOXTT为表达调控元件,以尿嘧啶合成相关基因URA3为筛选标记,构建了HPV16L1的重组表达质粒pYMOXU-HPV16。用SacII酶切质粒pYMOXU-HPV16使其线性化,电转化多形汉逊酵母菌株H-ura3,依据营养缺陷互补筛选重组菌株。通过PCR扩增及HPV16L1蛋白表达量分析表明已获得稳定高表达L1蛋白的重组汉逊酵母菌株HP-U-16L。摇瓶发酵条件的初步优化表明,以YPM(pH7.0)为基础培养基进行诱导培养,控制接种量使初始培养液OD600为1.0,每隔12h补加甲醇至终浓度为1%(V/V),37oC、200r/min条件下诱导培养72h后,HPV16L1蛋白的最高表达量为78.6mg/L。本研究为多形汉逊酵母源HPV16L1疫苗的研制奠定了基础。     

甾醇C-24甲基转移酶和甾醇C-8异构酶在酿酒酵母麦角甾醇生物合成中的调控作用

摘要：【目的】研究ERG6基因编码的甾醇C-24甲基转移酶和ERG2基因编码的甾醇C-8异构酶在酿酒酵母麦角甾醇生物合成代谢中的调控作用。【方法】通过PCR扩增克隆到酿酒酵母甾醇C-8异构酶的编码序列及其终止子序列,以大肠杆菌-酿酒酵母穿梭质粒YEp352为载体,以磷酸甘油酸激酶基因PGK1启动子为上游调控元件构建了酵母菌表达质粒pPERG2;同时,在本实验室已构建的ERG6表达质粒pPERG6的基础上,构建了ERG2和ERG6共表达的重组质粒pPERG6-2。将表达质粒转化酿酒酵母单倍体菌株YS58,依据营养缺陷互补筛选到重组菌株YS58(pPERG2)和YS58(pPERG6-2)。通过紫外分光光度法和气相色谱法分析重组菌株甾醇组分和含量。【结果】在ERG6高表达的重组酵母菌中,甾醇中间体和终产物麦角甾醇的含量均比对照菌高;而在ERG2高表达的酵母菌株中,无论甾醇中间体,还是麦角甾醇的含量均明显降低。ERG6和ERG2共表达重组菌株YS58(pPERG6-2)的麦角甾醇含量是对照菌株YS58(YEp352)的1.41倍,是ERG2单独高表达菌株YS58(pPERG2)的1.92倍,是ERG6单独高表达菌株YS58(pPERG6)的1.12倍。【结论】本研究首次证明甾醇C-24甲基转移酶催化的反应是酿酒酵母麦角甾醇合成代谢途径中的一个重要的限速步骤,该酶活性提高不但补偿了ERG2高表达对甾醇合成的负效应,而且使麦角甾醇含量进一步提高,为构建麦角甾醇高产酵母工程菌株提供了实验依据。