帘蛤科贝类rDNA内转录间隔区序列的研究

根据18SrDNA、5．8SrDNA和28SrDNA保守序列设计引物,应用聚合酶链式反应（PCR）扩增了文蛤（Meretrix meretrix L．）、青蛤（Cyclina sinensis G）、硬壳蛤（Mercenaria mercenaria L．）和江户布目蛤（Protothaca jedoensis L．）4种帘蛤科贝类的第一内转录间隔区（ITS1）和第二内转录间隔区（ITS2）序列,并进行了测序。结果表明,文蛤、青蛤、硬壳蛤和江户布目蛤的ITS1扩增产物大小分别为978bp、663bp、757bp和942bp,GC含量分别为61．55％、60．78％、62．48％和64．86％～64．97％,其中ITS1序列长度分别为900bp、585bp、679bp和864bp,是迄今已报道双壳贝类中变化范围最大的,GC含量分别为61．67％、61．03％、63．03％和65．51％～65．62％,江户布目蛤种内ITS1序列有个体差异;ITS2扩增产物大小分别为644bp、618～620bp、593bp和513～514bp,GC含量分别为61．18％、61．29％～61．81％、62．73％和61．48％61．60％,其中ITS2序列长度分别为412bp、386～388bp、361bp和281～282bp,GC含量分别为65．29％、65．21％～66．06％、67．87％和67．38％～67．62％,青蛤和江户布目蛤种内ITS2序列有个体差异。4种蛤ITS1和ITS2序列种间差异很大,有明显的长度多态性,ITS2种间序列相似度73．0％～89．1％,与ITS1的种间序列相似度48．7％～81．5％相比略高。此外,在4种蛤ITS1和ITS2序列中各发现2个与rRNA加工有关的保守区。通过对ITS1和ITS2序列的组装获得了4种蛤5．8SrRNA基因完整序列,序列长度都是157bp,GC含量57．96％～58．60％,4种蛤5．8SrRNA基因相对保守,种间序列差异度0-6．0％,共有10个变异位点,其中转换4处,颠换6处,硬壳蛤和江户布目蛤5．8SrRNA基因序列完全相同。以ITS2序列（包含5．8SrRNA和28SrRNA基因部分序列）为标记,调用北极蛤科的Arctica islandica相应序列数据作外群,构建了帘蛤科贝类的系统发育树,其拓扑结构显示江户布目蛤与硬壳蛤亲缘关系最近,青蛤与其他3物种的亲缘关系最远。     

奥利亚罗非鱼促性腺激素释放激素cDNA的原核表达及其免疫原性研究

促性腺激素释放激素(gonadotropin-releasinghormone,GnRH)是下丘脑分泌产生的神经激素,对脊椎动物生殖的调控起重要作用。为研究GnRH对奥利亚罗非鱼性腺发育的作用,构建了GnRHcDNA的原核表达载体并进行融合表达。利用RT-PCR方法从丘脑中扩增出长约400bp的目的序列GnRH基因,克隆至T载体中,经酶切鉴定和序列测定分析确认序列的正确性后将此片段克隆到表达载体pMAL-c2x中构建重组表达质粒pMAL-GnRH,并在大肠杆菌TB1中获得了高表达,目的蛋白约占菌体总蛋白的41.6%。菌体经溶菌酶裂解,制备无细胞抽提液,Amylose-sepharose柱层析后得到分子量为56kD单一条带的目的蛋白。目的蛋白经FactorXa酶切裂解,Amylose-sepharose过柱纯化后得到纯化的GnRH前体蛋白。以80μg/只的剂量4次免疫ICR小鼠,免疫小鼠可以检测到特异性针对GnRH前体蛋白的血清抗体应答,免疫组抗体水平显著高于空白组(P<0.05),且加强免疫第5周后抗体效价为0.707±0.320,达到高峰值,说明表达产物具有免疫原性,可以刺激机体产生免疫应答。     

人工诱导白鲢（hypophthalmichthys molitrix）雌核发育及性转

为了获得白鲢自交品系,以解决该鱼种退化问题,本文用失活鲤鱼精子诱导白鲢雌核发育,再用17α－甲基睾丸激素促使其发生性别转换。经紫外线照射过的锂鱼精子,遗传物质遭到破坏。用这种失活的鲤鱼精子与白链卵“受精”,精子不参与卵发育,但能激发卵的发育,得到单倍体“受精卵”。这种单倍体“受精卵”自身不能成活,要在41℃条件下热处理3分钟,当单倍体复制成二倍体以后才能继续发育。当雌核发育的鱼长到10cm时,将含有17α－甲基睾丸激素的Silastic管插入其腹腔中。激素通过管壁逐渐向外释放,影响鱼体性发育。待实验鱼性腺与对照白鲢一样都发育至第Ⅱ期时,可以观察到：实验鱼性腺发生了退化 现象（Fig.1)。制备血清,做等电聚焦电泳可以观察到：实验鱼的同功酶谱与白鲢鱼的相同,而不同于鲤鱼（Fig.2)。排除鲤鱼精子参与受精的可能。     

北京地区实验树晌的饲养管理方法

树鼩作为低等灵长类动物,在生物学研究中的价值日益引起研究者重视,将其作为实验动物的实验需求越来越多。作为南方亚热带动物,树嗣如何适应北方地区的生活是北方地区将其用作实验动物的前提。本实验室探索出适宜树购居住的饲养笼具,确定了饲养环境温度、湿度、光照时间、噪声及通风等条件,制定了规范化的卫生管理标准,建立了北京地区长期人工培育树晌的饲养管理方法,为今后利用树嗣进行中医药病证结合动物模型的研究奠定了基础。     

建鲤(Cyprinus carpio var. Jian)微卫星DNA亲权鉴定

利用16个微卫星座位对建鲤10个全同胞家系647个子代进行亲权鉴定。Cervus3.0分析表明,16个微卫星位点的平均多态信息含量为0.7025,平均等位基因数为6.63,期望杂合度平均为0.7405。当双亲未知时,累积排除概率为0.999225,已知单亲时的累积排除概率为0.999996,置信度为95%。进一步模拟分析表明,要达到亲权鉴定的要求在双亲未知时通常需要8～12个微卫星位点,已知单亲时需要5～8个微卫星位点。在双亲均未知的情况下进行亲权鉴定,94.6%的后裔找到了其父母本,真实鉴定率低于模拟分析预测值,分析可能是与候选亲本间存在亲缘关系、无效等位基因的存在以及分型错误等因素有关。9个建鲤全同胞家系的鉴定,为今后的遗传图谱构建、QTL定位及分子标记辅助育种研究奠定了基础。     

草鱼野生和养殖群体间遗传变异的微卫星分析

运用微卫星标记对江苏境内草鱼(Ctenopharyngodonidella)一个野生群体(邗江群体)和两个养殖群体(淡水中心群体和无锡前洲群体)遗传多样性进行了分析。在10个座位中,每个座位检测到的等位基因数2~8个。有效等位基因数、多态信息含量、期望杂合度、平均表观杂合度均以邗江草鱼野生群体最高,分别为3·9、0·5068、0·6939、0·7;无锡前洲草鱼养殖群体最低,分别为2·2、0·1796、0·5235、0·5286;淡水中心草鱼养殖群体各参数均介于两者之间,分别为3·5、0·2902、0·5418、0·5429。以上结果表明:草鱼野生群体遗传多样性更为丰富,而草鱼养殖群体存在杂合度降低,遗传多样性下降的现象。邗江草鱼野生群体与淡水中心草鱼养殖群体和无锡前洲草鱼养殖群体间遗传分化系数分别为0·219和0·246,而两个草鱼养殖群体间遗传分化系数为0·034。这表明草鱼野生群体与草鱼养殖群体间分化严重,而草鱼养殖群体间分化微弱。各座位分化程度的χ2检验结果表明,10个座位中有GM18、MFW1-1、MFW1-2三个座位群体间分化达到极显著水平,GM03-2、MFW5两个座位群体间分化差异显著,其他座位分化不显著。针对每个座位对各群体进行Hardy-Weinberg平衡检验发现:由于草鱼养殖群体在GM03-1、GM03-2、GM18三个位点杂合子缺失,草鱼野生群体在位点GM19杂合子过剩而严重偏离平衡。实验表明:近交容易引起草鱼遗传多样性下降,纯合速度加快。     

Keap1-Nrf2信号通路参与子宫内膜癌细胞增殖、转移、耐药机制的研究

目的:研究Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白1(Keap1)-核转录因子E2相关因子(Nrf2)信号通路对子宫内膜癌细胞生长、转移及耐药的影响。方法:选择代表I型子宫内膜癌细胞的KLE细胞株和代表II型子宫内膜癌的ARK2细胞株,采用real-time PCR和Western blot法测定两细胞株Keap1和Nrf2基因m RNA、蛋白表达,MTT法检测两细胞株对顺铂耐药性。对Keap1表达更低、耐药性更强的ARK2细胞株的Keap1基因过表达。Real-time PCR、Western blot、平板克隆实验、MTT法、Transwell迁徙、侵袭实验等方法研究ARK2细胞中Keap1过表达对Nrf2及下游靶基因表达、细胞生长、侵袭、耐药的影响。结果:在ARK2和KLE细胞中Nrf2基因m RNA表达无明显差异,ARK2细胞中Keap1基因表达无论是m RNA还是蛋白水平在的表达均要低于KLE细胞株,而Nrf2蛋白水平的表达在ARK2细胞株中则要明显高于KLE细胞株。Keap1表达较低的ARK2细胞较Keap1高表达的KLE细胞耐药性更高。ARK2细胞株中Keap1过表达能够明显下调Nrf2蛋白及下游基因ABCC2、γ-GCS表达;MTT实验和平板克隆实验表明Keap1过表达能够降低ARK2细胞增殖能力;Keap1过表达能够降低ARK2细胞迁徙和侵袭能力;Keap1过表达能够显著提高ARK2细胞对顺铂的敏感性。结论:Keap-Nrf2信号通路在子宫内膜浆液性癌细胞株ARK2中活化程度显著高于子宫内膜样癌细胞株KLE,Keap1对Nrf2蛋白表达调控是基于转录后的,且低表达的Keap1及高表达的Nrf2蛋白和肿瘤细胞的高耐药性有关。在子宫内膜浆液性癌细胞株ARK2中上调Keap1基因表达能够有效的下调Nrf2蛋白及其下游基因的表达,并降低肿瘤细胞的生长、迁徙、侵袭能力,且能提高肿瘤细胞对顺铂的敏感性。     

褪黑素对模拟干旱胁迫下北美红栎幼树幼树光合性能及抗氧化酶系统的影响

为研究干旱胁迫下施加褪黑素对北美红栎幼树光合性能和抗氧化酶系统的影响,以当年生北美红栎幼树实生苗为试验材料,利用不同浓度的聚乙二醇(PEG-6000)溶液模拟干旱,研究干旱胁迫对北美红栎幼树光合性能及抗氧化酶活性的影响。结果表明:在PEG模拟的干旱胁迫下,北美红栎幼树的光合作用受到抑制并破坏了体内的氧化还原平衡,抗氧化物酶活性提高。在干旱胁迫开始前喷施100μM的褪黑素能够提高北美红栎幼树清除活性氧的能力,维持干旱胁迫条件下较高的净光合速率并能有效地缓解由于干旱胁迫对植物造成的损伤。试验结果为实践中栽培管理北美红栎幼树提供了参考。     

叶面喷施有机碳对铁皮石斛碳水化合物代谢及Fe、Zn含量的影响

碳是植物体的结构与能量物质, 植物所需要的碳主要来自于自然界的二氧化碳, 就对植物生长需求而言, 远远满足不了对碳的需求, 植物常处于碳饥饿状态。为分析外施有机碳对铁皮石斛碳水化合物积累及微量元素铁、锌含量的影响, 通过叶面分别喷施20 mg·L–1的蔗糖和α-酮戊二酸, 研究了外施蔗糖和α-酮戊二酸对铁皮石斛总碳、总氮、总磷、几种糖类物质含量及蔗糖合成酶活性的影响, 分析了各测定指标之间的相关性。结果表明, 外施有机碳均显著提高了铁皮石斛总碳含量, 对总氮和总磷含量没有明显影响。施加α-酮戊二酸对铁皮石斛蔗糖、可溶性多糖、非结构性碳水化合物含量和蔗糖合成酶活性均有显著提高, 与对照相比, 分别提高了16.35%、29.76%、22.1%和40%。施加α-酮戊二酸显著提高了铁皮石斛铁、锌含量, 与对照相比, 分别提高了36.46%和7.23%。相关分析表明, 蔗糖合成酶与蔗糖、可溶性多糖、铁、锌和非结构性碳水化合物均呈极显著正相关(P<0.01)。可见, 施加α-酮戊二酸对提高铁皮石斛的可溶性多糖及微量元素铁、锌含量, 提高铁皮石斛抗逆性比蔗糖有更好的肥效; 通过对铁皮石斛叶面喷施有机碳α-酮戊二酸可以促进其生长发育、提高品质, 起到用量少、见效快的显著效果。     

CpG寡脱氧核苷酸触发中华绒螯蟹酚氧化酶原系统信号传导途径的研究

为探讨CpG寡脱氧核苷酸(CpG-oligodeoxynucleotides,CpG-ODN)激活中华绒螯蟹血细胞酚氧化酶原系统(prophenoloxidase system,proPO系统)的信号传导途径,使用一定剂量的CpGODN-1670、ODN-R以及几种细胞信号传导的激活剂或抑制剂体外处理中华绒螯蟹血细胞,通过检测胞内外酚氧化酶(PO)活性的变化,对CpG ODN触发proPO激活系统的信号传导途径进行评价。结果显示,ODN-1670与ODN-R均可触发蟹血细胞proPO激活系统,试验剂量的ODN-1670可促进血细胞内外已有的proPO转化为PO,而对proPO颗粒的释放具有一定的抑制作用;ODN-R则不仅可使proPO转化为PO,还可促进血细胞脱颗粒。两者的信号传导途径相似,可能都包含了G-蛋白介导的蛋白激酶C(PKC)途径,酪氨酸蛋白激酶(RTK)途径对ODN-1670的触发proPO激活系统的活化过程进行负调控。