靶向β淀粉样蛋白的阿尔茨海默病疫苗研究进展

阿尔茨海默病(AD)是一种以认知功能障碍和记忆减退为主要临床特征的神经退行性疾病。目前,β淀粉样蛋白(Aβ)被认为是AD免疫治疗的关键靶标,其疫苗研究包括多肽疫苗、DNA表位疫苗及病毒载体疫苗等。我们简要地对近年来AD疫苗研究进展进行了综述。     

重组PA4复制子病毒颗粒疫苗免疫原性的分析

目的:构建携带炭疽毒素保护性抗原第四结构域(PA4)基因的重组Semliki森林病毒(SFV)复制子病毒颗粒,并对其免疫原性进行研究。方法:将编码炭疽PA4的SFV复制子DNA载体pSCAR-SPA4,与辅助SFV DNA载体pSHCAR共转染BHK21细胞,制备表达PA4的重组复制子病毒颗粒;用重组复制子病毒颗粒疫苗免疫小鼠,并采用ELISA法检测其血清抗体水平和细胞因子IFN-γ和IL-4。结果:免疫小鼠血清中检测到较高的抗体水平,免疫小鼠的脾淋巴细胞经特异性抗原刺激后产生了明显的T细胞增殖反应并分泌产生了IFN-γ和IL-4。结论:重组PA4复制子病毒颗粒疫苗免疫小鼠后能够产生特异性的抗体反应和细胞免疫反应。制备的重组PA4复制子病毒颗粒极有潜力作为人用炭疽候选疫苗,为进一步研究新型炭疽疫苗奠定了基础。     

基于DNA和RNA的双功能Semliki森林病毒复制子载体的构建

以semliki森林病毒衍生的复制子载体pSFV1和辅助载体pSFV-helper2为骨架, 用CMV IE和T7启动子替换SP6启动子并在3′ UTR下游插入BGH转录终止子,构建了基于DNA和RNA的复制子表达载体pSMCTA和辅助载体pSHCTA。在DNA和RNA二种递送方式上证实该表达载体可高水平表达外源基因,与辅助载体共转染可制备具有感染能力并能表达外源基因的重组病毒颗粒。构建的基于DNA和RNA的双功能复制子载体显著地提高SFV载体应用范围,在体外可用于高水平表达外源基因及大规模制备重组病毒颗粒,在体内也可用于研制复制子疫苗和基因治疗载体。     

B型肉毒毒素保护性抗原Hc在大肠杆菌中的可溶性高表达

目的：通过序列优化及表达条件改进,在大肠杆菌中高效可溶性表达B型肉毒毒素保护性抗原He（Bont／B-He）。方法：对Bont／B-He基因片段优化,用大肠杆菌常用密码子替换稀有密码子,并将（C＋C）含量由76．2％降至56-3％;人工合成多条具有重叠互补序列的寡核苷酸片段,采用重叠延伸PCR方法获得了Bont／B-He的全长基因,并构建了原核可溶性表达载体;将经酶切和测序鉴定正确的重组质粒转化大肠杆菌B121（DE3）感受态细胞,用IPTC诱导Bont／B-He的表达并进行纯化及Western印迹鉴定。结果和结论：目的蛋白在大肠杆菌B121（DE3）中获得了可溶性高表达,占菌体裂解液上清总蛋白的26．7％,表达量达到30mg／L,是目前国内外已知表达的最高水平;经Ni柱一步纯化后,目的蛋白纯度可达到80.3％,为肉毒毒素中和抗体的制备及亚单位疫苗的研究奠定了基础。     

A型肉毒毒素受体结合区Hc在重组SFV复制子载体中的表达

为了在哺乳动物细胞中表达A型肉毒毒素Hc抗原, 构建了含A型肉毒毒素受体结合区Hc基因的基于RNA和DNA的重组Semliki森林病毒(Semliki forest virus, SFV)复制子表达载体。RNA和DNA复制子载体转染BHK21细胞后, 经间接免疫荧光、Western印迹和ELISA检测, 结果表明非分泌型和分泌型的Hc抗原在细胞中都得到了有效地表达; 而且复制子表达载体与辅助病毒载体共转染均可制备高滴度的重组病毒颗粒, 该重组病毒颗粒感染细胞后, 也都能表达Hc抗原。以上结果表明, 基于RNA和DNA的重组SFV复制子表达载体在细胞中均可有效地表达Hc抗原和制备具有感染能力并能表达Hc抗原的重组病毒颗粒。基于RNA和DNA的重组SFV复制子表达载体的构建和含A型肉毒毒素受体结合区Hc基因的重组病毒颗粒的获得, 为进一步观察SFV复制子疫苗的免疫原性奠定了基础, 从而为A型肉毒毒素新型疫苗的研制提供了新途经。     

A型肉毒毒素Hc结构域在大肠杆菌中的高水平表达及免疫原性

对A型肉毒毒素受体结合区Hc基因的全序列进行优化和人工合成,获得了全长1287bp,编码429aa的Hc基因。以pTIG-Trx为原核表达载体,实现了Hc在大肠杆菌中的高效可溶性表达及纯化,该表达水平可占可溶性全菌总蛋白的36%～53%,经一步亲和层析纯化可获得电泳级纯度的目的蛋白,在常规培养条件下,产量达到30mg/L以上。然后,纯化的重组蛋白Hc免疫小鼠后能够诱导产生高滴度特异性的抗体,也能诱导产生特异性的细胞免疫应答反应。小鼠体内A型肉毒毒素中和试验结果表明免疫组小鼠血清中含高滴度的体内中和抗体。结果表明,利用本实验的原核表达系统不仅能够高水平可溶性地表达A型肉毒毒素受体结合区Hc,而且重组Hc具有良好的免疫原性,可以用于制备治疗性抗毒素和作为亚单位候选疫苗用于预防A型肉毒毒素中毒。     

基于DNA的Semliki森林病毒复制子载体体内外高水平表达外源基因

基于DNA的复制子载体显著地提高了复制子载体的应用范围,在体外可用于高水平表达外源基因,大规模制备重组病毒颗粒,在体内可用于复制子疫苗和基因治疗载体研究.将复制子RNA的cDNA置于RNA聚合酶Ⅱ启动子和转录终止子控制下时,基于RNA的复制子载体可转变为基于DNA的复制子载体.当DNA载体转染细胞后,第一阶段,RNA聚合酶Ⅱ启动子在核内起始合成RNA,经过加工和修饰后运输到细胞质中,相当于复制子RNA,第二阶段,该RNA自我复制及表达外源基因,相当于病毒RNA复制循环.在成功地构建了基于DNA和RNA的双功能复制子表达载体pSCTA和辅助载体pSHCTA的基础上,为了获得高效的基于DNA的复制子载体,对其进行改进而构建了共4种不同的基于DNA的semliki森林病毒复制子,通过对表达载体和相应的辅助载体表达报告基因及对制备重组病毒颗粒的能力进行比较,获得了复制能力提高的复制子载体pSCAR和pSHCAR.该表达载体pSCAR可高水平表达外源基因,与辅助载体pSHCAR共转染可制备高滴度的重组病毒颗粒,并且也能表达抗原基因.另外,报告基因在DNA复制子载体注射的小鼠体内得到了高水平表达,并且DNA免疫小鼠后也诱导产生高滴度特异性抗体以及细胞免疫反应.结果表明,经过改造SFV复制子载体,获得了高效的基于DNA的SFV复制子载体.该复制子载体增强了原复制子载体应用能力,并有潜力作为复制子疫苗和基因治疗载体.     

质粒骨架的CpG修饰对DNA疫苗免疫原性的影响

目的：探讨不同类型的CpG对DNA疫苗免疫应答的影响。方法：将3种不同类型的CpG通过骨架改造的方式引入核酸疫苗的质粒载体骨架中作为内源性佐剂,以LacZ为模式抗原,对其免疫小鼠后特异性抗体水平、细胞免疫水平和细胞因子水平进行比较和分析。结果：3种不同类型的CpG序列在体内能够不同程度地增强免疫小鼠的特异性抗体水平和细胞免疫水平,并且不同类型的CpG序列可能具有不同的免疫调节作用。结论：作为内源性佐剂,CpG免疫刺激DNA序列可不同程度地提高模式抗原特异性的免疫反应,可根据不同抗原的特点加以利用。