试论蛋白质组学的专利保护

蛋白质组学是后基因组时代的新兴学科,是当今生命科学领域新的增长点.蛋白质组学的研究为药物筛选、新药开发、临床诊断及新陈代谢途径研究等提供理论依据和研究基础.对蛋白质组学领域中涉及的蛋白质药物、数据库及检测分离设备等的专利保护现状和策略进行了初步探讨,并强调了加强我国蛋白质组学知识产权保护特别是专利保护的重要性.     

2003～2007年中国风疹病毒基因特征分析

本研究用Vero细胞或Vero/SLAM细胞从我国10个省(直辖市、自治区,下同)2003～2007年风疹暴发和散发病例的咽拭子标本中分离到57株风疹病毒,用RT-PCR方法扩增了57株风疹病毒E1基因1 107个核苷酸的片段,并对该PCR产物进行序列测定和分析.结果提示,在基于WHO基因定型靶序列739个核苷酸片段构建的基因亲缘关系树上,其中55株风疹病毒株属于1E基因型,相对于其他国家的1E基因型,形成一个独立分支;另外2株风疹病毒属于2B基因型.57株风疹病毒大部分核苷酸的突变为无义突变,氨基酸序列高度保守,除了2株风疹病毒在E1蛋白血凝抑制和中和位点区域第212位氨基酸由Thr变为Ser,其他病毒株均无重要抗原位点的改变;所有我国已分离到的1E基因型风疹病毒在E1蛋白第338位氨基酸共享突变位点(Leu338→Phe338),而其他基因型以及其他国家的1E基因型风疹病毒在该位点均未发生突变,提示该氨基酸(Phe338)可能是我国1E基因型风疹病毒所特有.2003～2007年在我国10个省均分离到1E基因型,而2B基因型只在2006年从四川省的越南输入病例中分离到,提示1E为绝对优势基因型,2B基因型为输入基因型.与1979～1984年和1999～2002年我国流行的风疹基因型不同,发生了基因型的更替,近年我国风疹的流行是由1E基因型为主的风疹野病毒的多个传播链引起.     

Caspase-3在豚鼠内淋巴积水耳蜗中的表达

目的观察Caspase-3在豚鼠内淋巴积水耳蜗中的表达。方法实验分正常对照组和实验组,每组10只豚鼠。用破坏并阻塞豚鼠内淋巴囊的方法造成豚鼠内淋巴积水模型。3周后处死豚鼠,取耳蜗分别用石蜡及火棉胶包埋、切片,免疫组织化学方法观察caspase-3在耳蜗的表达。结果caspase-3在豚鼠内淋巴积水耳蜗中表达呈阳性,阳性区域为耳蜗外侧壁和螺旋神经节细胞。结论caspase-3在豚鼠内淋巴积水耳蜗中呈阳性表达,提示在内淋巴积水病理过程中存在耳蜗细胞凋亡。     

青藏高原高山植物麻花艽的传粉生态学研究

对青藏高原东部麻花艽 (Gentiana straminea)海北居群的传粉生态学进行了 3a连续的观察和实验。试验表明自然去雄、人工自交和杂交处理均结实 ,而人工去雄套袋和自然套袋不结实。麻花艽自交亲合 ,但必须依赖传粉媒介才能完成授粉过程 ,不存在无融合生殖。野外捕捉到 14种访花昆虫 ,它们分别属于 2个纲 ,7个目 ,8个科。观察和分析了各种昆虫的访花行为后 ,认为苏氏熊蜂 (Bombus sushikini)是麻花艽有效而稳定的传粉者。测量表明麻花艽花蜜通道的深度和苏氏熊蜂的舌长基本吻合。苏氏熊蜂的访花频率在 10 :0 0～ 12 :0 0 ,13:0 0～ 15 :0 0和 16 :0 0～ 18:0 0时间段没有差别 ,单花的访花频率为 0 .0 0 5次 / (花· min)。和其它高山植物相比 ,青藏高原高山植物麻花艽的访花频率较高。熊蜂传粉和高频率的访花维持了麻花艽在极端寒旱的青藏高原环境下的有性生殖。此外 ,高频率的访花对于维持该地区高山植物的生殖保障具有重要的现实意义 ,但是否具有普遍性 ,还有待研究更多的高山代表类群。     

黄土孢粉HF处理方法

黄土孢粉提取是黄土孢粉分析的关键,到目前为止,虽然有一些比较好的工作方法,但是都存在一定的问题。本文主要提出HF法处理黄土孢粉的一些应该注意之处。由于黄土中有大量碳酸盐以及胶结物,且SiO2含量也较高,需要对标准的HF法进行相应的调整,在处理过程中多次进行HCI和HF处理。对甘肃静宁酸刺沟剖面261个黄土孢粉样品的进行HF法处理的结果表明,运用这种改进过的方法可以更加有效地提取孢粉。     

人绒毛膜促性腺激素β亚基单一B-细胞表位(β5、β9或β8)融合蛋白的表达和纯化

作为开发新型实用性人绒毛膜促性腺激素(hCG)疫苗的一种尝试, 我们已构建若干组合靶抗原三个线性B- 细胞表位和外源强T- 细胞表位的基因工程hCG嵌合肽。为了检测用这些嵌合肽免疫的动物血清中是否能产生抗各表位的三种抗体,本研究选用能在大肠杆菌中高表达和与生物素亲和性强且特异(方便通过亲和层析纯化)的链霉亲和素为载体,分别构建了三种含β-hCG不同单一线性B_细胞表位(β5,β9和β8)的融合蛋白。在链霉亲和素基因下游多克隆区EcoRⅠ和Hind Ⅲ位点插入各表位编码基因片段(带TAA终止密码子)的pTSA-18重组质粒, 转化BL21(DE3)pLysS宿主菌后, 它们在IPTG诱导下均能以较高水平表达各自目的融合蛋白,而且它们的表达产物在Western blot鉴定中都能被抗各表位特异的多抗或单抗或抗报告表位单抗识别。用改良的制备性PAGE方法可以一步纯化电泳均一性高于95%的三个融合蛋白, 它们的收得率相对1L培养物约为5 mg。作为化学合成表位肽的替代物, β-hCG三个单一B- 细胞表位融合蛋白的可获得性将有助于所构建hCG基因工程嵌合肽以及其他hCG疫苗,也包括它的DNA疫苗的免疫原性分析。     

猪传染性胸膜肺炎放线杆菌毒素apxII基因无药物抗性标记突变株HBC-/GFP+的构建及其生物学特性研究

通过使用枯草芽胞杆菌一个蔗糖敏感sacB基因发展了一种依靠蔗糖的负向筛选系统 ,这种方法允许没有标记突变的基因进入胸膜肺炎放线杆菌染色体。首先 ,构建了猪传染性胸膜肺炎放线杆菌毒素apxII基因GFP插入失活型的重组质粒pOSAKCG ,其中一个表达盒含有氨苄青霉素基因和以外膜蛋白omlA作为启动子表达sacB基因。重组质粒pOSAKCG通过电穿孔转化 ,它的突变apxIICA基因与野生型亲本菌株胸膜肺炎放线杆菌HB03染色体上野生型apxIICA基因发生同源交换 ,两步法筛选获得了apxII基因突变株HBC^-GFP⁺,PCR和Southernblot对突变株进行初步鉴定 ,进一步对突变株的一些生物学特性 ,包括它的溶血活性、免疫原性、生长特性及其对小鼠的安全性进行了研究。结果表明 ,无药物抗性标记突变株的构建是成功的。该突变株的构建为进一步研究突变株作为载体和疫苗奠定了坚实的基础。     

伪狂犬病病毒TK-/gG-缺失株的构建及其生物学特性研究

将伪狂犬病病毒TK^-/gG^-/LacZ⁺突变株的基因组DNA与含有缺失的gG基因的转移质粒pUSKBB共转染猪肾传代细胞PK-15,待完全病变后收获病毒进行空斑试验,用PCR筛选gG缺失的重组病毒。空斑纯化3次后,随机挑取空斑进行PCR扩增,证实所获得的病毒为均一的TK^-/gG^-缺失株。遗传稳定性试验表明该重组病毒能在PK-15细胞上稳定遗传,动物试验表明该缺失株对Balb/c小鼠极为安全且能保护Balb/c小鼠抵抗致死量PRV强毒的攻击。该突变株的获得为我国伪狂犬病的控制和根除奠定了基础。     

海石竹的离体快繁及核型分析

以海石竹 (Armeriamaritima)的叶片为外植体 ,经离体培养诱导产生愈伤组织 ,再分化形成不定芽 ,并经过继代增殖和壮苗生根 ,获得完整的再生植株 ,最后对其再生植株进行核型分析。结果表明 ,海石竹叶片的愈伤组织诱导和分化的适宜培养基为MS +BA 1 .0mg/L +NAA 0 .2mg/L ,诱导初期进行 7d暗培养 ,最佳增殖培养基为MS+BA 1 .0mg/L +NAA 0 .1mg/L ,生根培养基为MS+NAA 0 .2mg/L。以上培养基均含蔗糖3 0 g/L ,琼脂 5g/L ,pH 5 .8。海石竹的核型公式为 2n=2x=1 8=1 0m +8sm ,存在染色体数目变异的现象。     

ES细胞体外定向分化为成熟肝细胞的实验研究

探讨了肝细胞在胚胎干细胞（ES cell）体外诱导分化系统中成熟分化的条件、机制及其鉴定方法.利用TGF, bFGF、HGF等细胞生长因子进行BALB/c小鼠ES细胞向肝细胞方向的定向诱导.利用反转录聚合酶链反应（RT-PCR）、免疫细胞化学（ICC）和放射免疫法（RIA）动态检测肝细胞特异性基因和蛋白AFP,ALB,G6P,TAT,CK8, CK18等在培养体系中的表达,并测定肝细胞的尿素合成功能,最后测定肝细胞分化率.结果,肝细胞特异基因AFP, ALB,G6P和TAT最早分别于第3、9、11、13天表达,肝细胞特异蛋白AFP,CK8,CK18和ALB最早分别于第7、9、9和11天开始表达.第12天开始检测到尿素出现,浓度为8.3 μmol/L,并随培养时间延长而浓度逐渐增加.最后,测得生长因子诱导组肝细胞的分化率为32％,对照组肝细胞分化率为8%.说明肝细胞可以在ES细胞体外诱导分化系统中出现并成熟分化,bFGF、HGF、OSM等可以明显提高细胞分化率和成熟度,有望成为解决肝功能替代疗法中细胞来源问题的新希望.