DNA条形码技术在大型红藻分子鉴定中的应用

本研究对浙江省枸杞岛贻贝养殖区大型海藻资源进行了调查,在形态学观察的基础上,选取93株红藻样品运用DNA分子条形码技术进行分子鉴定分析。采用的3个分子标记分别为rbcL(叶绿体基因组中1,5-二磷酸核酮糖羧化/加氧酶大亚基基因),COI(细胞色C氧化酶亚基I)和UPA(23S rRNA基因片段,通用质体扩增区)基因片段。通过实验,我们共扩增出rbcL基因片段79条,扩增成功率为84.95%;共扩增出COI基因片段63条,扩增成功率为67.74%;共扩增出UPA基因片段76条,扩增成功率为81.72%。3个分子标记的测序成功率分别为:rbcL基因78.49%,COI基因29.03%,UPA基因72.04%。COI基因的扩增效率和测序成功率均低于rbcL和UPA基因。基于3个基因构建(Neighbor-joining,N-J)系统进化树表明,rbcL基因可以将红藻样品归类为5目,6科,7属,12种;COI基因可以将样品归类为4目,5科,5属,5种;UPA基因可以将样品归类为6目,7科,8属,11种。rbcL、COI和UPA 3个基因结合可以将样品归类为7目8科11属21种。研究表明rbcL基因以及UPA基因较适合做为鉴定大型红藻的分子标记,COI基因做为红藻分子标记的潜力有待进一步开发和研究。     

条斑紫菜R-藻红蛋白提纯工艺研究

对条斑紫菜叶状体R-藻红蛋白提纯方法进行了研究和分析。首先分别采用冻融法、化学试剂法、溶胀法等单一及组合细胞破碎方法对条斑紫菜细胞进行破碎,结果表明溶胀 组织捣碎法效果最佳。其次用25%～60%饱和度范围内的硫酸铵沉淀法粗提藻红蛋白,发现25%～45%硫酸铵分步沉淀法效果最好,再经结晶法盐析纯度(D565nm/D280nm)达到2.088。盐析液用SephadexG-25层析柱脱盐,再经羟基磷灰石(HA)柱层析,纯度可达到4.98。R-藻红蛋白的最大吸收峰在565nm,其室温荧光发射峰为578nm。SDS-PAGE结果显示,R-藻红蛋白可分为α、β两个亚基,Mr分别为17.0×103和19.0×103。     

光强和温度变化对曲浒苔光合作用的调节机制

实验针对曲浒苔(Ulva flexuosa)光合作用系统对光照与温度变化的响应进行分子水平探究, 从原初反应、电子传递、光合磷酸化到碳的固定等方面对曲浒苔光合作用响应机制进行解析。叶绿素合成基因在高温高光[30℃、400 μmol/(m2·s)]环境下表达下调。类胡萝卜素合成基因在低温高光[4℃、400 μmol/(m2·s)]环境下表达下调。电子传递链、CF₁F₀-ATP合酶等基因对温度和光照变化的适应能力较弱, 各实验组的相关基因表达量均呈现下调趋势。聚光复合体基因表达量上调。各实验组的光系统Ⅱ反应中心基因均下调, 锰稳定蛋白则普遍上调。不同C₄途径关键酶基因在各个环境中的变化趋势不一致。综合实验结果可以发现曲浒苔对于温度和光照变化具有一定的耐受度, 分析得出温度对曲浒苔光合作用基因的影响较大, 而且高温高光对曲浒苔的影响最显著。     

条斑紫菜藻红、藻蓝蛋白α和β亚基基因序列测定及分析

为了获得江苏吕泗的条斑紫菜藻红蛋白α(Pea)和β(Peb)亚基、藻 蓝蛋白α(Pca)和β(Pcb)亚基基因的DNA序列,本文对其基因进行了克隆、 序列测定及分析.根据已发表的基因序列(DQ666487.1)设计引物,对提取自 条斑紫菜叶状体的DNA进行PCR和电泳鉴定,产物经测序证实获得藻红蛋白 序列1 357 bp (HM008263.1)和藻蓝蛋白序列1 335 bp (HM008262.1).上述 两段序列与已报道的条斑紫菜相关序列(DQ666487.1)同源性均为99％,与 其它几种紫菜相关序列同源性为88％～98％.两段序列均采用多顺反子转录 策略,排布顺序为5′Untranslated Regions(UTR)- Peb -间隔区- Pea -3 ′UTR 和 5′UTR- Pcb -间隔区- Pca -3′UTR.文中对基因翻译所得氨基 酸序列做了理化参数、功能位点及空间构型的预测.基于对序列开放阅读框 、启动子、Shine-Dalgarno (SD)序列的分析,本文对条斑紫菜分类地位进 行了讨论.     

条斑紫菜藻胆蛋白提纯方法优化探索

采用溶胀法与组织捣碎法相结合的紫菜叶状体细胞破碎方法.研究了不同物液比、缓冲液浸泡时间和硫酸氨盐析次数对藻胆蛋白纯度和产率的影响,对比了各种羟基磷灰石的层析效果,并对所得藻红蛋白和藻蓝蛋白做了吸收光谱、荧光发射光谱和SDS-PAGE鉴定.结果表明,在物液比为1:5,浸泡时间为36h时,紫菜综合破碎效果最佳;经过4次硫酸氨盐析后,藻红蛋白和藻蓝蛋白的纯度最高,分别达到1.71和0.98,采用Siegelman的方法制备的羟基磷灰石一次层析所得藻红蛋白和藻蓝蛋白的纯度最高,分别达到4.73和4.42,产率分别为0.144%和0.042%,且光谱和电泳鉴定结果均达到商品化要求.     

矮壮素对苦草矮化特征及生理指标的影响

沉水植物生长过高引起水体污染问题受到人们高度重视。本文在实验室模拟条件下,研究了0(CK)、0.01、0.02、0.10、0.20、0.50、0.75、1.00和1.25g.L-1共9个不同浓度矮壮素对苦草(Vallisnerianatans)矮化特征及生理指标的影响。结果表明:不同浓度处理30d后苦草株高具有显著差异性(P<0.05),且浓度越高矮化效果越显著;矮壮素使苦草叶宽增加、根长缩短,其中浓度在0.02～0.20g.L-1时苦草根冠比增加,浓度在0.01～0.50g.L-1时苦草株数增加明显;矮壮素浓度在0.10～0.50g.L-1时,苦草湿重增加61%～123%,将从水中或底泥中吸收更多N、P等营养物质,增强其净化水质的能力;当矮壮素浓度为0.02g.L-1时,不仅苦草矮化的效果较好,占据空间相对较小,而且苦草根长生长较长,根冠比较大,叶绿素含量增加,SOD、POD酶活性升高,苦草抗逆性增强,延缓植株衰老。因此,0.02g.L-1浓度矮壮素对苦草矮化较为适宜。     

条斑紫菜藻红、藻蓝蛋白逐级放大的纯化工艺

采用“破碎-盐析-层析”的方法纯化条斑紫菜藻胆蛋白,并在提取规模上逐步放大。首先在综合比较凝胶层析去盐效率后,从Sephadex G-25、G-100、S-300和CL-6B中选择G-25作为实验流程中的去盐填料,其次将提取流程的初试原料条斑紫菜量逐步放大,选取了1g、20g和400g三个量,结果表明随着初试紫菜量逐步放大,最终所得藻胆蛋白中吸收光谱纯度>3.2的蛋白产率依次提高,其中400g冻干紫菜的藻红蛋白产率为0.323％,藻蓝蛋白产率为0.148％。由此认为该实验工艺流程具有规模放大的潜力,这为高纯度藻胆蛋白的规模生产提供了一条可行的方案。     

基因芯片在海洋微藻研究中的应用前景

基因芯片通常指DNA芯片,其基本原理是将大量的寡核苷酸分子固定于支持物上,然后与标记的样品进行杂交,通过检测杂交信号从而获取结果。多年来,我国在医药疾病研究、微生物检测等领域已成功研制出多种基因芯片,取得了骄人的成绩,但在对海洋微藻研究的应用上成果较少。现着力从实际应用的角度阐述基因芯片及其在海洋微藻研究中的应用。     

条斑紫菜丝状体总RNA提取方法比较

目的:为了获得质量较高的条斑紫菜丝状体总RNA,对几种常用提取方法进行研究。方法:以条斑紫菜自由丝状体为材料,比较了用异硫氰酸胍法、CTAB法、SDS/酚法、TRIzol法、RNAplant法提取的RNA的质量和纯度。结果:异硫氰酸胍法提取RNA的成本低,但纯度不高;CTAB法产率较小,且不能完全去除多糖或蛋白质;SDS/酚法未能获得完整的RNA;TRIzol法未能见到5SrRNA条带,且带有杂带;而RNAplant法提取RNA的质量好、纯度高、提取效率高,其D260nm/D280nm值为1.836,经逆转录得到的双链cDNA扩增产物长度在200bp以上。结论:实验结果表明RNAplant法更适于条斑紫菜丝状体总RNA的提取。     

真江蓠(Gracilaria verrucosa)对网箱养殖海区的生态修复及生态养殖匹配模式

2006年8～9月,在浙江象山港花鲈(Lateolabrax japonicus)养殖网箱中吊养真江蓠(Gracilaria verrucosa)对网箱养殖造成的水体富营养化进行生态修复研究.通过45d内的平面监测、定点跟踪监测和断面监测,结果表明:该网箱养殖区水体呈严重富营养化状态,营养状态指数(E)为32.00,其营养盐分布由高浓度的中心区向周围150m非养殖水域扩散;真江蓠对养殖区的富营养化海水具有较好的修复效果:江蓠生态修复区及其相邻网箱中水体PO4-P、NO2-N、NH4-N和NO3-N含量显著低于非修复区(P＜0.01),修复区海水PO4-P、NO2-N、NH4-N和NO3-N浓度比非修复区分别降低22%～58%、24%～48%、22%～61%和24%～47%.养殖真江蓠45d后,修复区水体DO浓度和透明度显著高于非修复区(P＜0.05),DO平均提高28%,透明度平均提高30%;而修复区水体Chl-a浓度显著低于非修复区(P＜0.05),平均降低49%.通过建立基于N平衡的鱼藻生态养殖模式,每收获1kg花鲈至少需要匹配江蓠4.7 kg wet wt才可实现对鱼类排放N的完全吸收.因此网箱内栽培江蓠的混合生态养殖模式,可平衡因经济动物养殖所带来的额外营养负荷,有利于实现动物养殖环境的自我修复.