乙醇酸氧化酶基因在巴斯德毕赤氏酵母中的表达

将菠菜乙醇酸氧化酶基因片段克隆至表达载体pPIC3．5k。提取重组质粒,进行限制性酶切鉴定。重组质粒用Sal I酶切线性化,电导入法转化毕赤酵母(Pichia pastoris),在缺乏组氨酸的RDB平板筛选重组子,提取酵母的染色体基因组进行PCR扩增鉴定整合情况,用甲醇诱导表达。结果表明,SDS-PAGE电泳显示表达蛋白的分子量约为39．8kD,与文献报道的乙醇酸氧化酶分子量接近。酶的活力达到了40．8IU／g湿菌体,比不含有目的片断的对照菌酶活提高了17倍,确认了导入的乙醇酸氧化酶基因片段在酵母中高效表达。     

雷公藤甲素对病毒性心肌炎细胞凋亡及Fas/FasL 蛋白表达的研究

目的:研究雷公藤甲素对柯萨奇病毒B3病毒(CVB3)感染的病毒性心肌炎小鼠心肌细胞凋亡和Fas/FasL蛋白表达的抑制作用,探讨TP治疗病毒性心肌炎的作用机制。方法:将Balb/c小鼠随机分成4组作为动物模型,分别为对照组、模型组、利巴韦林组和TP组。对照组腹腔注射生理盐水,其余三组腹腔注射CVB3,利巴韦林组和TP组小鼠分别予以相应的药物治疗后,测定各组小鼠存活率及心肌病变积分,采用末端转移酶标记技术(TUNEL法)检测小鼠心肌细胞凋亡,免疫组化法检测Fas/FasL蛋白阳性表达。结果:空白对照组心肌无病变,利巴韦林组、TP组与模型组相比有显著性差异(P<0.01)。正常组鲜见心肌细胞凋亡,模型组细胞凋亡率较正常组显著增加(P<0.01),治疗组利巴韦林组和TP组凋亡率比模型组明显降低(P<0.05,P<0.01)。模型组Fas/FasL表达比正常组显著增多(P<0.01),治疗组利巴韦林组和TP组较模型组显著降低(P<0.01)。结论:雷公藤甲素具有通过抑制Fas/FasL蛋白的表达,减缓心肌细胞凋亡,达到抑制病毒性心肌炎从而保护心肌细胞的作用。     

东南景天对锌、镉复合污染的反应及其对锌、镉的吸收和积累特性

Sedum alfredii Hance has been identified as a new Zn-hyperaccumulator native to China. In this study, responses and metal accumulation of S. alfredii were examined under Zn/Cd complex polluted conditions. The results showed that optimal growth of S. alfredii in terms of the maximum dry matter yield was observed at Zn/Cd complex level of 500/100 祄ol/L. Plant cadmium (Cd) or zinc (Zn) concentrations increased with increasing Cd or Zn supply. During the 20 d treatment, the highest Cd concentration in the leaves reached 12.1 g/kg at Zn /Cd level of 50/400 祄ol/L and that of Zn in the stems was 23.2 g/kg at Zn/Cd level of 1 000/50 祄ol/L. The distribution of Cd in different plant parts decreased in the order: leaf ＞ stem≥ root, whereas that of Zn was: stem ＞ leaf ≥ root. The accumulation of Cd and Zn in the shoots and roots of S. afredii increased with the increasing of Zn/Cd supply levels, peaked at Zn/Cd levels of 250/400 and 500/100 祄ol/L, respectively. The highest Cd and Zn uptake by the shoots was approximately 5 and 11 mg/plant, and was over 20 and 10 times higher than those in the roots, respectively. Zn supply at levels ≤ 500 祄ol/L increased plant Cd concentrations, whereas high Zn supply decreased root Cd but did not affect leaf Cd concentrations in S. alfredii. Low Cd supply increased Zn concentration in the leaves, but Cd supply higher than 50 祄ol/L considerably reduced root Zn concentrations, especially at low Zn level. These results indicate that S. alfredii can tolerate high Zn/Cd complex levels and has an extraordinary ability to hyperaccumulate not only Zn but also Cd. It could provide a new valuable plant material for understanding the mechanisms responsible for co-hyperaccumulation of Zn and Cd as well as for phytoremediation of the Cd/Zn complex polluted soils.     

一种新的铅富集植物--富集生态型东南景天

对浙江一古老铅锌矿区的土壤和植物种群进行调查后发现一种新的具有耐铅特性和铅富集能力的植物--景天科景天属东南景天(Sedum alfredii Hance),称为铅富集生态型植物.进一步比较和分析了不同浓度硝酸铅处理对富集和非富集生态型东南景天的生长及其对铅的吸收特性的影响.结果表明, 320 mg Pb/L处理对富集生态型的地上部分生长无显著影响,而非富集生态型在20 mg Pb/L时即出现受害症状.富集和非富集生态型的地上部分铅含量、根系铅含量以及单株铅积累速率均随处理浓度的增加而表现出先升后降的变化趋势.其中富集生态型的地上部分铅含量、根系铅含量以及单株铅积累速率最高可达到514 mg/kg、13 922 mg/kg和8.62 μg/plant/d,分别是非富集生态型的2.27、2.62和7.16倍.由于具有生长速度快和高积累铅的能力,从植物修复的观点来说,东南景天铅富集生态型在铅污染土壤的修复方面具有巨大的潜力.     

水杨酸钠对胰岛素抵抗大鼠胰岛素受体底物-1的影响

目的探讨抗炎药水杨酸钠对胰岛素抵抗大鼠胰岛素敏感性的影响及其作用机制。方法分别给大鼠静脉输注脂肪乳+肝素,脂肪乳+肝素+水杨酸钠和生理盐水7 h,并在输注的最后2 h,行清醒状态高胰岛素-正血糖钳夹试验,测定血浆葡萄糖、游离脂肪酸(FFA)、胰岛素和C-肽水平,检测肝脏、肌肉中胰岛素受体底物-1(IRS-1)及307位丝氨酸磷酸化的IRS-1表达。结果输注脂肪乳大鼠葡萄糖输注率(GIR)是输注生理盐水大鼠的45%,水杨酸钠可使GIR提高1.3倍(P0.01)。脂肪乳输注组大鼠肝脏及肌肉中307位丝氨酸磷酸化的IRS-1分别为生理盐水输注组大鼠的3倍和3.8倍(P0.001),输注水杨酸钠,肝脏、肌肉307位丝氨酸磷酸化的IRS-1下降45%、20%(P0.05)。结论 FFA增高引起肝脏及肌肉中307位丝氨酸磷酸化的IRS-1水平增高,可能是导致胰岛素抵抗发生的机制之一,应用水杨酸钠,大鼠肝脏及肌肉组织中IRS-1丝氨酸磷酸化水平下降,胰岛素抵抗改善。抗炎药物水杨酸钠可能通过抑制FFA引起的IRS-1丝氨酸磷酸化,而发挥改善胰岛素抵抗的作用。     

利用Pimelobacter simplex DM18从马来酸转化制备D-苹果酸

利用PimelobactersimplexDM18从马来酸高效制备D 苹果酸 ,优化了菌株DM18的发酵条件 ,最佳发酵培养基组成为 (g/L) :柠康酸 ,2 5 ;葡萄糖 ,3;磷酸二氢钾 ,10 5 ;硝酸铵 ,2 0 ;硫酸镁 ,0 2 5 ;七水硫酸亚铁 ,0 0 15 ;酵母膏 ,2 8;玉米浆 5 ;pH值 7 2。在最适培养基中 30℃培养 30h ,菌体OD660 可达到 4～ 4 5 ,酶活达到 14g/ (L·h) (反应菌液OD660 为 10 )。采用间歇添加马来酸钠反应 32h ,D 苹果酸质量浓度为 15 3 9g/L ,D 苹果酸的收率达到 96 6 7%。,经离子配位体色谱分析 ,产物D 苹果酸光学纯度为 96 98%。     

ProNGF在大肠杆菌中的表达、纯化和复性

将含有前导肽的人神经生长因子基因(proNGF)克隆在原核表达载体pET15b中, 转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS, 经IPTG诱导实现了目标融合蛋白的高效表达。SDS-PAGE分析表明表达蛋白占全菌总蛋白的20%左右, 表达蛋白主要以包涵体的形式存在。用6 mol/L的盐酸胍溶解包涵体后, 通过Ni2+-NTA柱纯化, 获得纯化的目标融合蛋白, 电泳谱带扫描分析表明蛋白纯度可达90%以上。Western blotting检测显示, 表达产物有较强的免疫学活性。经肠激酶作用后得到proNGF非融合蛋白, 分子量为27 kD, 100 mL表达菌液可获得13.1 mg proNGF蛋白。用透析复性的方法将目的蛋白重折叠, 复性率为18%, 在重折叠过程中前导肽发挥了一定的积极作用。用PC12细胞进行生物活性鉴定, 结果显示复性后的proNGF蛋白具有良好的生物活性。     

海因酶与氨甲酰水解酶产生菌的鉴定及分布

利用Biolog微生物鉴定系统和16S rDNA序列分析相结合的方法对自行筛选的24株海因酶和氨甲酰水解酶产生菌进行了鉴定。海因酶与氨甲酰水解酶产生菌主要分布在Bacillus,Geobacillus,Brevibacillus,Aneurinibacillus,Microbacterium,Pseudomonas,Kurthia和Empedobacter等菌属,特别的是,Kurthia和Empedobacter是新的海因酶和氨甲酰水解酶产生菌属,说明海因酶和氨甲酰水解酶产生菌在细菌中分布较广泛。进一步分析比较发现,D-海因酶产生菌主要分布于Pseudomonas,Agrobacterium等菌属中,而大部分L-海因酶产生菌分布于Bacillus,Geobacillus,Microbacterium等菌属中,说明D-海因酶产生菌与L-海因酶产生菌分布特点具有一定的种属倾向性。这些工作不仅提供了多种海因酶和N-氨甲酰水解酶的生物材料,而且对双酶的结构与功能及分子进化研究等具有重要意义。     

人神经生长因子基因在大肠杆菌中的克隆、表达及产物纯化

从人胎盘组织中提取总DNA, 经PCR扩增编码人β神经生长因子（β-NGF）成熟肽的基因,并克隆到大肠杆菌表达载体pET15b中。重组质粒pET15b-NGF经测序与报道的完全一致。重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS,经IPTG诱导表达得到16kD的目的蛋白带,与预期的大小一致,NGF表达量约占全菌总蛋白的25%.经过亲和层析柱（Ni2+-charged IDA his-bind column）纯化后得到了单一的NGF蛋白条带,蛋白纯度可达90%以上,从每升表达菌液中可以得到4.56mgNGF。表达产物的Western 印迹鉴定结果显示：重组人神经生长因子能与兔抗人β-NGF的多克隆抗体发生特异性结合反应,在16kD处出现单一的条带,表明诱导表达的重组NGF具有免疫学活性。鸡胚背根神经节感觉神经元鉴定试验表明,本实验表达的重组NGF具有良好的生物学活性。     

节杆菌A.pascens DMDC12锰超氧化物歧化酶基因的克隆和表达

利用PCR技术对自行筛选的高度耐盐节杆菌Arthrobacter pascensDMDC12中的超氧化物歧化酶基因进行克隆,获得了节杆菌A.pascensDMDC12的SOD新基因(GenBank收录号为DQ779150)。将该基因与原核表达质粒载体pET-22b( )连接,构建重组质粒pET-sodAP,将质粒转化至表达宿主菌E.coliBL21(DE3),构建基因工程菌BL21/pET-sodAP。用异丙基硫代--βD-半乳糖苷(IPTG)诱导重组SOD蛋白表达,用酶活和SDS-PAGE分析表达产物,表达产物的相对分子质量为2.4×104,与sodAP推测的长度相同。表达目的蛋白占菌体可溶性蛋白的23%,比酶活达915.07 IU.mg-1,是对照菌株的8.73倍,具有较高的表达。本研究为进一步进行重组Mn-SOD的研究和应用奠定了基础。