地中海诺卡氏菌(Nocardia mediterranei)合成力复霉素代谢调节的研究——Ⅰ.硝酸盐对地中海诺卡氏菌合成力复霉素SV的促进作用

本文报导了硝酸盐促进力复霉素生物合成现象的初步观察结果。加入硝酸钾0.8％,地中海诺卡氏菌(Nocardia mediterranei)NG 12—4合成力复霉素SV的产量可增加1.7倍。在发酵96小时之前加入硝酸盐均能促进力复霉素SV的合成,但产量的增加随加入时间的延迟而降低。硝酸钾在促进产量的同时,使菌体生长减少,看来硝酸盐对力复霉素SV的合成与菌体生长之间起着调节作用。 洗涤菌体试验指出,硝酸盐的加入诱导了力复霉素合成所需要的酶系,蛋白陈不能代替硝酸盐,进一步说明硝酸钾的作用并不是作为氮源利用。在蛋白质合成抑制剂氯霉素存在下,硝酸盐不再能促进力复霉素的合成,说明氯霉素抑制了硝酸盐所诱导的酶系的合成。 铵盐明显地抵消了硝酸盐对力复霉素合成的促进作用,可能是由于铵盐阻遏了硝酸还原酶的合成。 KNO~3~-菌体与-KNO~3~-菌体的形态有明显差别。两种菌体的脂肪含量也不相同。 KNO~3~-一菌体的脂肪含量为5.7％,而-KNO~3~-菌体则高达13.6％,看来硝酸盐在脂肪合成与力复霉素合成两条途径之间起着调节作用。     

尿素对热带假丝酵母(Candida tropicalis)合成长链二元酸途径的调节 Ⅰ.抑制和阻遏作用

尿素明显地影响热带假丝酵母的长链二元酸合成。当存在适量尿素(0.1％)时,长链二元酸大量合成,但当尿素量增加至0.2％以上时,长链二元酸基本上不积聚,但短链二元酸,主要是庚二酸有所增加。 尿素的利用呈S形曲线,说明尿素可能经酶的诱导利用。在发酵中当尿素量增至0.2％以上时,整个发酵过程均残留少量尿素,它对长链二元酸的合成起着调节作用。 发酵中加入和尿素含氮量相当的酒石酸铵或硫酸铵以代替尿素,或在适量尿素的发酵过程中,补加入和0.1％尿素含氮量相当的氨时,均不明显抑制长链二元酸的合成,但在不同时间补加入0.1％尿素时,则受强烈抑制。 适量尿素(0.1％)培养的休止菌体,在不同时间补加尿素都显著抑制长链二元酸的合成,表明尿素对已生成的酶系具有抑制作用。但过量尿素培养的休止菌体,不能转化烷烃生成长链二元酸,说明过量尿素所培养菌体的长链二元酸合成酶系受到显著的阻遏作用。 适量尿素培养的休止菌体,在不同时间加入氨,它的抑制作用远较尿素为低。用适量尿素含氮量相当的铵盐培养的休止菌体,亦具有类似现象,但过量氨培养的休止菌体转化时仍能生成多量长链二元酸。以上均说明尿素对长链二元酸合成的影响不是氨而是尿素分子本身起了抑制和阻遏作用。 尿素分子的化学结构类似物——硫脲和胍也具     

从国际生物工程第二届讨论会(Biotech)看生物工程进展(会议报告)

(Ⅰ)会议概况 第二届国际生物工程讨论会(Biotech—84)在美国华盛顿于九月十日到十二日召开。参加会议的各国代表约八百人,我国参加的代表有五人。会议报告的内容丰富,印有九百多页的论文集一册,共有七十多篇论文。报告可概括为三个方面: 1.生物工程商业——包括生物工程对工业和社会的冲击,从冒险到效益,集资问题、市场调节、专利、资源、新领域、各国政策—是合作还是冲突。     

芳香途径终产物和中间体对力复霉素SV生物合成的调节作用

本文报道了芳香化合物对力复霉素生物合成和芳香途径开始的DAHP合成酶活力的调节作用。首先,洗涤菌体实验结果指出,色氨酸对力复霉素sV合成有明显抑制,苯丙氨酸和酪氨酸本身作用不明显。其次,酶活力测定结果表明,色氨酸抑制力复霉素生物合成是由于它对DAHP合成酶的反馈抑制;同时,在无细胞抽出液中酪氨酸和苯丙氨酸对色氨酸抑制也显示了协同作用。此外,力复霉素芳香前体(C7N)的结构类似物对氨基苯甲酸和对羟基苯甲酸对抗生素合成也有影响,主要影响c,N的生物合成。     

提高三角酵母细胞DAO表观活力的透性化研究

三角酵母(Trigonopsis variabilis)的D-氨基酸氧化酶(D-amino acid oxidase,DAO,EC1.4.3.3)是一种胞内酶,完整细胞并不呈现酶促活性。为了获得三角酵母细胞的较高表观活力,需对细胞进行处理以改变壁和膜对反应底物和产物的通透性。研究中比较了冻融、丙酮、丁醇和十六烷基三甲基溴化铵(Cetyltrimethylammonium bromide,CTAB)等理化因子的透性化效率,并对丙酮的透性化条件进行了优化。证明丙酮的透性化作用与溶剂浓度、保温时间和温度有关。30%～35%丙酮浓度,4～28℃保温,可得到最大酶活力。透性化所需时间极短,在5min内即可完成。同时,透性化细胞中的DAO比无细胞抽提液中的酶对热更为稳定。用丙酮透性化细胞作为生物催化剂可有效地转化头孢菌素C(Cephalosporin C, CPC)为戊二酰-7ACA(Glutaryl-7-ACA,GL-7ACA)。     

头状轮生链霉菌中丝裂霉素C抗性基因的克隆及功能研究

头状轮生链霉菌(\%Streptoverticillium caespitosus\%)ATCC27422是抗肿瘤药物丝裂霉素的主要产生菌,实验通过诱变筛选获得不产生丝裂霉素同时对丝裂霉素C敏感的阻断变种S6,并以它为受体宿主,以质粒pIJ699为载体,建立野生型头状轮生链霉菌菌株ATCC27422的基因库。采用鸟枪法克隆技术,从库中筛选获得含有丝裂霉素C抗性基因的62kb外源片段的克隆子。将含此外源片段的质粒pLX5导入变铅青链霉菌(\%Streptomyces lividans\%)获得表达。并且首次成功地运用电穿孔法将pLX5导入野生型菌株中,使其对丝裂霉素C的抗性大幅度提高：最低抑制浓度(MIC)由原来的200μg/mL上升至1000μg/mL以上。摇瓶发酵实验表明：单位菌量的ATCC27422(pLX5)的丝裂霉素产量高于野生菌株ATCC27422,因此丝裂霉素C抗性与产量之间存在一定的相关性。     

丙氨酸对热带假丝酵母NPcoN22长链二元酸发酵的调节

本文研究了丙氨酸对热带假丝酵母(Candida tropicalis)NPcoN22长链二元酸发酵的调节,并把它与尿素的调节作了比较。在蔗糖利用、烷烃利用、菌体生长、发酵液pH变化和十四烷一1,14一二羧酸积累诸方面以及在三羧酸循环、乙醛酸循环、过氧化氢酶等酶的活力方面,丙氨酸具有与尿素相同的调节作用。丙氨酸加尿素作为混合氮源或在正常发酵过程中补加尿素或丙氨酸,其调节效果与过量尿素或过量丙氨酸单独存在条件下的情况一样,说明尿素和丙氨酸的调节作用具有相加效应。发酵过程中菌体对丙氨酸的利用特点表明了丙氨酸是菌体生长的限制因子。Β一氧化的抑制剂——丙烯酸能显著提高十四烷一1,14-二羧酸的积累。     

Burkholderia piCkettii中D-乙内酰脲酶基因(dha)的克隆、测序及表达

对一株能转化D,L－对羟基苯乙内酰脲为D－对羟基苯甘氨酸的菌株MMR003进行了细菌分类学鉴定,该菌为皮氏伯克霍尔德氏菌（Burkholderia pickettii)。实验通过Southern杂交,部分文库构建和筛选,并经一系列亚克隆分析,获得一长度为1374bp的完整开放阅读框,编码458个氨基酸的D－乙内酰脲酶基因。用该基因序列构建的高表达质粒xXZPH2转化E.coliBL21(DE3),经IPTG诱导后,检测到D－乙内酰脲酶活性。该基因编码的氨基酸序列经Blast同源比较分析与放射形土壤杆菌NRRL B11291所产相应酶有85％的同源性。以D,L－对羟基苯乙内酰脲为底物测得的表达酶的活力为0.66u/mL,比相同条件下所测出发菌株MMR003的酶活提高了2倍。     

安普霉素的生物合成:辛二糖C7′-N上甲基的甘氨酸来源

安普霉素是一类结构特殊的氨基糖苷类抗生素,其分子中含一个稀有的辛二糖结构单元.迄今为止,尚无关于安普霉素生物合成途径及其前体化合物的完整报道.研究发现,向发酵培养基中添加甘氨酸和丝氨酸均可以出现在菌体生长保持基本不变的情况下促进抗生素产量的现象,表明甘氨酸和/或丝氨酸可能参与了安普霉素的合成.[2-13C]甘氨酸示踪实验的核磁共振(NMR)检测结果表明,甘氨酸专一地掺入安普霉素辛二糖环C7′-N甲基.同时发现,菌体胞内的S腺苷甲硫氨酸(SAM)水平上升与外加甘氨酸的量呈正比,但是甲硫氨酸的加入会抑制安普霉素的合成.据报道,甲硫氨酸对结构中含有甲基取代基的抗生素,如对rapamycin的生物合成中转甲基过程有抑制作用.由此推测,尽管甲硫氨酸本身对抗生素产量呈抑制作用,甘氨酸仍然可能通过甲硫氨酸循环提供甲基.此外,[2-13C,15N]丝氨酸的示踪实验结果表明丝氨酸也可能作为安普霉素的限制性前体物参与了NH2的合成.     

地中海拟无枝菌酸菌(Amycolatopsis mediteranei)U-32硝酸还原酶的定位、纯化及性质

在力复霉素ＳＶ研究中,发现硝酸盐对抗生素合成呈现多效性作用,不仅大幅度提高产量,还对产生菌——地中海拟无枝菌酸菌生理产生多方面的影响,从而提出整体性调节的结论．这一多效性作用是由硝酸盐所引起的,为此对硝酸还原酶进行了研究．首先,通过原生质体渗透裂解发现地中海拟无枝菌酸菌Ｕ－３２的硝酸还原酶是一个胞质酶．该酶极不稳定,缓冲液中加入硝酸钾、甘油等保护剂能极大地提高其稳定性．通过硫酸鱼精蛋白沉淀,硫酸铵分级分离,Ｐｈｅｎｙｌ－ＳｅｐｈａｒｏｓｅＣＬ４Ｂ、Ｂｉｏ－ＧｅｌＡ１．５ｍＤＥＡＥ－Ｓｅｐｈａｃｅｌ和ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－７５柱层析等多步纯化得到了电泳纯的硝酸还原酶．该酶为一７９ｋＤ的单亚基酶,每分子酶含有约２．２９原子的钼,但并不含有非血红素铁、酸不稳定硫、ＦＭＮ及ＦＡＤ,其等电点为６．２,反应最适ｐＨ为７．２,最适温度为４０℃．对硝酸根的Ｋｍ值为１３．３μｍｏｌ／Ｌ．同时分析了该酶的吸收光谱．