新世纪微生物学者的一项重要任务——未培养微生物的分离培养

扼要介绍近年来有关分离培养未培养的微生物 (Unculturablemicroorganisms)、扩大生态环境微生物多样性的认识等方面取得的重要进展。首先 ,是采用非常规的 ,甚至认为有毒性的电子传递物质 ,获得了多种新生理型(physiotypes)的纯种微生物。另外 ,在多种生态域中分离出非同寻常的微生物 ,扩大了这些生境微生物的多样性的视野 ,如普遍存在于大洋的浮游细菌SAR11类群 ,其微小菌体呈半月形 ,在海水中细菌浓度可达 (10⁵～10⁶) mL ,基因组估计为 1.54Mb。更值得注意的是从极端高温环境分离的嗜热纳米古细菌属 (Nanoarchaeota) ,其基因组仅有500kb ,是已知原核生物的最小者。应重视的是在分离这些多样性微生物的过程中所发展的新型培养技术 ,如微滴胶囊化法和扩散小室法都是具有革命性的方法 ,既有通用性 ,又无需昂贵设备 ,对今后这一领域的发展将起重要推动作用     

从透明颤菌血红蛋白谈到植物缺氧与转基因作物

扼要介绍透明颤菌血红蛋白基因在多种微生物的表达、调节和生理功能,特别是在生物工程方面可能的应用。但最值得重视的是这一基因在烟草中的表达及其生理效应,它为我们提出一个重要的问题,就是植物是否缺氧,透明颤菌血红蛋白基因很可能是构建转基因作物的重要元件。     

力复霉素产生菌地中海拟无枝菌酸菌U32丙氨酸脱氢酶基因克隆及表达

丙氨酸脱氢酶(EC1411)可逆催化丙氨酸脱氨生成丙酮酸和NADH。它是生物体内的氨基酸代谢和氨同化途径的关键酶。在地中海拟无枝菌酸菌(Amycolatopsis mediterranei)U32中,丙氨酸脱氢酶的活力与力复霉素的生物合成有负相关现象,其活力受KNO3全局效应的调控。根据结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)和天蓝链霉菌(Streptomyces coelicolor)的丙氨酸脱氢酶氨基酸的保守序列和地中海拟无枝菌酸菌U32对氨基酸密码子的使用偏好,设计一对简并PCR引物。以此引物从地中海拟无枝菌酸菌U32中扩增到一555bp的片段,并以此片段为探针从地中海拟无枝菌酸菌U32 基因组cosmid文库中成功的克隆到了丙氨酸脱氢酶结构基因(ald)。它编码了一个371个氨基酸的蛋白质,基因的GC含量为72.5％,符合链霉菌的基因结构特征。在起始密码子的上游6个碱基处,有一典型的链霉菌核糖体结合位点(RBS)：AGGAGG,第75位的氨基酸为赖氨酸,是丙酮酸结合位点。以pET28b为载体,在E.coli BL21(DE3)中高效表达了ald基因。用IPTG在22℃时诱导得到的丙氨酸脱氢酶活力最高。用HisTag柱纯化了表达的丙氨酸脱氢酶。酶学性质研究表明该酶专一性以LAla和NAD(H)为底物。     

展望即到来的“分子农业”

在过去20余年里,植物生物技术领域中最值得重视的是多种转基因植物的建成,并已在一些国家大面积种植,转基因植物另一方面的进展是合成有医疗价值的多肽、蛋白质、包括抗体、抗体表位、复杂蛋白质等。这里主要介绍转基因植物生产的医疗用多肽、蛋白质,特别是作为口服疫苗在动物和临床试验的成功,预示这种新的用药途径将对第三世界人民的健康起到重大作用。由于转基因口服疫苗不需通过常规发展反应器,仅仅依赖于农业,因此有人提出“分子农业”一词,以显示其优越性。     

GL-7-ACA酰化酶的分离纯化及性质研究

CU334是高表达GL-7-ACA酰化酶工程菌,其菌悬液用超声波处理后,经硫酸铵分级沉淀、DEAE-Sephadex A-50离子交换柱层析、DEAE—纤维素DE-52柱层析、Sephadex G-200凝胶过滤及羟基磷灰石吸附柱层析等步骤,得到了凝胶电泳均一的GL-7-ACA酰化酶蛋白,纯化了22倍,得率4.0％,比活力为13.8U/mg。用浓度梯度PAGE测得GL-7-ACA酰化酶的分子量为134kD,用SDS-PAGE测得两个亚基分子量分别为15.5kD和58.4kD。用PI法测得等电点为3.5。GL-7-ACA酰化酶反应最适pH为7.0。反应最适温度为37℃,GL-7-ACA酰化酶对底物GL-7-ACA的K_m值为0.50mmol/L,V_(max)为13.10U·mg~(-1)。Ca²⁺、EDTA和巯基乙醇对该酶有激活作用,Cu²⁺、Fe²⁺和Mg²⁺等有一定程度的抑制作用。产物7-ACA、戊二酸均为GL-7-ACA酰化酶的反竞争性抑制剂,其K_1值分别为16.58mmol·L~(-1)和9.88mmol·L~(-1)。     

无机磷对力复霉素合成的调节

本文报道无机磷抑制力复霉素产生菌地中海诺卡氏菌U-32中力复霉素(SV)的合成。随着丰富培养基中无机磷浓度的增加,SV的合成受到明显抑制,最高抑制率达sO％,而阔体生长则增加65％。不同时间加入无机磷对抗生素产量的影响是不相同的,在抗生素合成前(O一48h),无机磷的加入能严重影响SV的合成,但在合成期(72 h以后)加入则几乎不影响SV的产量。提高培养基中无机磷的起始浓度,使菌体合成脂肪量增加70％：甲基丙二酰CoA羧基转移酶和甲基丙二酰CoA羧基变位酶的活力受到明显抑制：菌体内腺苷化台物ADP、ATP的含量在整个发酵期都明显增加,细晦内能荷水平也因培养基中无机磷的起始浓度增加而提 高。     

石油发酵长链二元酸的研究——(Ⅳ)、热带假丝酵母(Candida tropicalis)休止细胞转化正烷烃为相应长链二元酸的研究

热带假丝酵母(Candida tropicalis)变种N-15的休止菌体能转化十五烷为十三烷1:13二羧酸。菌龄48小时休止菌体转化活力最高。转化的最适反应系统为pH 7`5之0`5 M磷酸缓冲液。通气量对转化有很大影响,在高通气条件下,菌浓为15×10~8/毫升时,十三烷1:13二羧酸产量可高达109克/升。而且休止菌体可将从癸烷至十七烷的正烷烃氧化为相应碳链的长铸二元酸,产量都很高。转化的方法工艺简单,效率高,有应用价值。N-15休止菌体还可以氧化不同长度碳链的醇、醛及一元脂肪酸,但不能氧化烯烃及二元醇,可能N-15的烷烃初始氧化不经过脱氢及二元醇氧化途径。     

地中海诺卡氏菌(Nocardia mediterranei)合成力复霉素代谢调节的研究——Ⅱ、硝酸盐对地中海诺卡氏菌代谢途径的调节

地中海诺卡氏菌(Nocardia mediterranei)的硝酸还原酶是底物—诱导酶,和细菌一样以NADH为专一性电子供体,并可能在细胞膜上,但与细菌不同,对超声波不敏感。加入硝酸盐促使菌体的力复霉素合成能力提高的同时,诱导硝酸还原酶和亚硝酸还原酶的合成,但需较长的诱导期。同时戊糖循环的G-6-P脱氢酶、6-P-G脱氢酶、莽草酸脱氢酶以及三羧酸循环的异柠檬酸脱氢酶、苹果酸脱氢酶亦相应提高。G-6-P脱氢酶和莽草酸脱氢酶活力的提高,可由莽草酸途径提供合成力复霉素的芳香环来源,三羧酸循环酶活力的提高看来是在脂肪合成与多聚酮(polyketide)合成之间起着调节作用,使菌体合成更多的力复霉素的环桥部份。至于硝酸盐如何引起这一系列酶活力的变化而使力复霉素的合成增加,尚有待进一步深入研究。     

Burkholderia pickettii中D-乙内酰脲酶基因(dha)的克隆、测序及表达

对一株能转化D,L-对羟基苯乙内酰脲为D-对羟基苯甘氨酸的菌株MMR003进行了细菌分类学鉴定,该菌为皮氏伯克霍尔德氏菌(Burkholderia pickettii)。实验通过Southern杂交,部分文库构建和筛选,并经一系列亚克隆测序分析,获得一长度为1374bp的完整开放阅读框,编码458个氨基酸的D-乙内酰脲酶基因。用该基因序列构建的高表达质粒pXZPH2转化E.coliBL21(DE3),经IPTG诱导后,检测到D-乙内酰脲酶活性。该基因编码的氨基酸序列经Blast同源比较分析与放射形土壤杆菌NRRL B11291所产相应酶有85%的同源性。以D,L-对羟基苯乙内酰脲为底物测得的表达酶的活力为0.66u/mL,比相同条件下所测出发菌株MMR003的酶活提高了2倍。     

热带假丝酵母多倍体变种的细胞色素P450和尿素在烷烃代谢中的作用

建立了可行的细胞色素 P450测定方法。考察了以烷烃为单一碳源的酵母细胞色素P450的一氧化碳差示光谱,峰值约为455nm。观察了烷烃培养的酵母细胞色素 P450在生长期中的消长。比较了十四醇、十四醇添加苯巴比妥、以及正十四烷等三种不同培养条件下酵母细胞色素P450的含量和发酵产物的成份。结果表明,细胞色素 P450为烷烃转化成二元酸所必需。烷烃为单一碳源培养酵母时,培养基中过量尿素(0.2%以上)促进烷烃利用和酵母生长,降低细胞色素 P450生成和二元酸的积累。根据上述实验结果和本研究室以前报道,提出了烷烃代谢调控模式。