腺相关病毒载体介导的人内皮抑素的体外表达及对内皮细胞抑制作用的研究

抗血管生成基因治疗是一有希望的抑制肿瘤生长及转移的方法.在实验中构建了含有人内皮抑素(endostatin)基因的重组腺相关病毒载体rAAV-hE.所包装纯化的重组病毒滴度达0.5×1012v.g./ml.rAAV-hE能有效感染培养细胞,EIA法检测培养液上清中内皮抑素浓度达36.42ng/ml.rAAV介导所表达的内皮抑素对人脐静脉内皮细胞(ECV-304)和牛毛细血管内皮细胞(BCE)具有抗增殖抑制作用,抑制率分别为68.1%和41.6%.此结果为进一步的动物实验奠定了基础,表明重组腺相关病毒载体介导的抗血管生成有望应用于肿瘤基因治疗.     

不同药剂对小麦赤霉病和白粉病的田间防效试验评价

小麦赤霉病和小麦白粉病是小麦生产中的重要病害,本研究通过田间试验明确了不同药剂对小麦赤霉病和白粉病的综合控制效果.试验结果表明,试验药剂对小麦赤霉病的防治效果较好,病穗防效和相对防效均达90%以上,其中氟唑菌酰羟胺防治效果最佳,病穗防效在94%以上,相对防效在93%以上.小麦白粉病于发病初期用药,防控效果最佳,大发生年份若发病初期用药仍不能控制其扩展,可在扬花初期使用40%环丙唑醇结合小麦赤霉病一并防控.     

抗AAV2单克隆抗体的制备及特性研究

以纯化的重组AAV2病毒颗粒为抗原免疫小鼠,获得7株稳定分泌抗AAV2衣壳蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株,其中B10和G4两株单克隆抗体具有中和活性,抗体亚型分别为IgG1和IgG2a型。对这两株单克隆抗体与rAAV病毒结合的特性进行了研究。单克隆抗体B10和G4对rAAV2病毒颗粒的结合均具有良好的血清型特异性,并且这种特异结合作用不被肝素阻断。这两株抗体都不阻断AAV2病毒与敏感细胞的结合,提示它们与病毒颗粒的结合位点都不处于AAV2病毒与主要受体结合的部位内。Western blotting检测结果显示,B10与AAV2的三种衣壳蛋白VP1、VP2和VP3均能结合,而G4不能与AAV2的这三种衣壳蛋白结合。这说明B10与AAV2结合的位点位于衣壳蛋白VP1、VP2和VP3的重叠部分处并且可能是线性表位,而G4则可能是针对AAV2病毒颗粒构象表位的抗体。这两种结合特性不同的单克隆抗体为研究AAV2病毒颗粒的表面特性和感染特性提供有用的工具。     

高通量miRNA活性谱检测发现BHK21细胞中miR-206高活性

用我们建立的活细胞miRNA活性谱检测技术测定BHK21、HEK293和Vero三种肾来源细胞系中58种miRNA活性谱,发现miR-206在BHK21细胞中具有特征性高活性.鉴于miR-206是典型的横纹肌特征性miRNA,进一步以小鼠成肌细胞C2Cl2及人胚肾细胞HEK293为对照,检测了BHK21细胞中miR-206的活性及表达水平.之后,用马血清诱导培养BHK21细胞,检测诱导前后BHK21细胞中骨骼肌肌球蛋白重链(Slow skeletal myosin heavy chain,MHC)表达情况,miR-206活性和表达水平以及受miR-206负调控的Connexin43(Cx43)的表达水平.结果发现,miR-206在BHK21细胞中活性和表达水平都明显高于C2C12细胞;马血清诱导后,BHK21细胞中MHC表达水平升高,miR-206活性和表达水平都升高,而Cx43表达水平下降.结果提示BHK21细胞具有成肌细胞特性.本研究首次发现BHK21细胞中miR-206的高活性,从miRNA角度证实了BHK21细胞来源于肾间质细胞,而不是肾实质细胞.研究结果还提示BHK21细胞有可能作为一种体外模型用于miR-206的功能研究.     

腺相关病毒载体介导的Endostatin及K1-5蛋白抗肿瘤血管生成协同作用

为研究腺相关病毒载体介导的内皮抑素(Endostatin)及K1-5蛋白抗肿瘤血管生成协同作用,实验中用含有Endostatin及K1-5基因的重组病毒rAAV-hE和rAAV-K5分别感染BHK-21细胞,并表达分泌出内皮抑素和K1-5蛋白,EIA法测定培养液上清中内皮抑素浓度达36.42ng/m l,免疫斑点印迹实验表明rAAV-K5可介导K1-5的体外表达。重组腺相关病毒(rAAV)介导所表达的内皮抑素和K1-5蛋白对血管内皮细胞增殖具有抑制作用。二者对人脐静脉内皮细胞(ECV-304)的抑制率分别为68.1%和63.1%,对牛毛细血管内皮细胞(BCE)的抑制率分别为41.6%和34.0%。同时二者还有协同效应,用rAAV-hE和rAAV-K5同时感染BHK-21细胞,表达产物对人脐静脉内皮细胞和牛毛细血管内皮细胞的抑制率分别为70.8%和43.8%。动物实验表明,重组病毒rAAV-hE和rAAV-K5转入荷有人肺肿瘤细胞的裸鼠,对肿瘤细胞生长具有抑制作用,同时二者具有协同抗肿瘤作用。     

利用分泌型荧光素酶体外长期监测小鼠肝脏microRNA活性

活体动物microRNA（miRNA）检测技术对阐明miRNA的生物学功能非常重要.但是,目前缺乏一种方便灵敏的实时反映活体动物miRNA活性及其变化的体外监测手段.通过在分泌型荧光素酶Gluc（Gaussia princeps luciferase）mRNA的3′非翻译区插入相应miRNA的靶序列构建一系列miRNA传感器.将miRNA传感器体外转染培养细胞和通过水动力注射方法转染小鼠肝脏,通过检测细胞培养上清和外周血液中的Gluc来反映细胞内和活体动物肝脏的miRNA活性.结果显示,CMV启动子驱动的miRNA传感器可以长期监测体外培养细胞中的miRNA和短期监测小鼠肝脏的miRNA,但由于启动子在肝脏的沉默不能用于长期监测肝脏miRNA;CAG启动子驱动的传感器则成功地实现了对肝脏内源性miR-122,miR-142和miR-34a以及对肝脏过表达的miR-34a的长期实时监测.利用以Gluc为报告基因的miRNA传感器,通过检测外周血Gluc可以方便地在体外长期连续监测小鼠肝脏的miRNA.     

表达HCV包膜蛋白的两种重组腺相关病毒疫苗的制备及免疫原性分析

重组腺相关病毒载体(rAAV)可在动物体内高水平地持久表达外源基因,本研究采用两种rAAV载体(rAAV1与rAAV2)构建了表达丙型肝炎病毒中国分离株包膜糖蛋白(E1E2)的载体疫苗并以之免疫小鼠,分别采用免疫荧光证实其表达与总抗体,用HCV假病毒系统检测其中和抗体水平,用ELISpot分析其细胞免疫应答,结果表明:rAAV1-E1E2重组载体疫苗单针免疫激发的体液应答明显高于rAAV2-E1E2,rAAV1-E1E2单针注射后3个月可在肌肉组织中检出E2蛋白表达及特异性T细胞应答。上述结果提示HCV重组腺相关病毒载体疫苗单针免疫可引起明显持久的体液与细胞免疫应答。     

HSV-tk基因在基因治疗中的应用研究进展

近年来,对恶性肿瘤的基因治疗已提出了多种方案,其中,向肿瘤细胞内导入“自杀基因(Suicide gene)”随之激活自杀机制的策略在某些实体瘤的治疗中受到重视,这类“自杀基因”包括Ⅰ型和Ⅱ型单纯疱疹病毒胸苷激酶基因(HSV1-tk,HSV2-tk)、水痘带状疱疹病毒胸苷激酶基因(VZV-tk)、大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶基因(EC-cd)等。目前最常用的“自杀基因”是HSV1-tk基因。截至1995年2月,美国NIH已通过了4项用HSV1-tk基因转移联合抗病毒药物Ganciclovir(GCV)     

以HSV-1扩增子载体构建的新型重组AAV载体包装系统

将缺失两端ITR的AAV -2基因组克隆于HSV -1扩增子载体获得了质粒pHSV AAV .以HSV- 1tsK株为辅助病毒感染转染了该质粒的Vero细胞 ,可获得一种具有包装重组AAV质粒能力的混合毒种 .连续传代可使其包装能力迅速升高 ,至 5～ 6代达到最高并趋于平稳 .此混合毒种中 ,含有包装了多拷贝AAV -2基因组的复制缺陷性假型HSV- 1病毒 ,它可表达AAV -2编码的复制与包装所需的各种反式蛋白 ;同时也含有HSV -1tsK病毒 ,它提供AAV -2复制与包装所需的全部辅助病毒功能 .实验结果也表明 ,HSV -1tsK病毒的复制为混合毒种辅助重组AAV载体的包装所必需 .这项研究首次报道了一种全新的重组AAV载体包装系统 ,与传统的双质粒共转染、腺病毒辅助包装方案相比 ,本系统简便易行 ,并明显提高了重组AAV的包装效率 .