人工锌指核酸酶突变EGFP基因的功能分析

锌指核酸酶技术在基因定点修饰中具有效率高和特异性好等特点,并成功应用于数十种生物。目前,该技术是否能应用羊上尚未报道。为了敲除转基因山羊标记基因 (EGFP),构建了一对针对EGFP外显子上的锌指核酸酶表达载体,将其电转染至转EGFP基因胎儿成纤维细胞中,研究了锌指核酸酶突变EGFP基因的效率和方式,利用基因显微注射单细胞获得获得的转基因 (EGFP) 细胞系作为锌指核酸酶的靶细胞。结果显示,通过锌指核酸酶的突变作用,转染后的细胞发绿色荧光比例下降,测序结果显示在EGFP外显子中插入1个碱基G,导致编码EGFP基因的阅读框改变,从而起到基因突变的作用。结果表明,文中构建的锌指核酸酶对EGFP基因有突变作用,可以为以后获得无标记基因供核细胞进行体细胞核移植生产克隆羊奠定基础。     

球形芽孢杆菌Ts—1毒蛋白的分离纯化

Bacillus sphaericus strain Ts-1 is highly insecticidal to larvae of the mosquito. It's insecticidal component is toxic proteins. The toxin was extracted from spore-crystal complexes by disruption in a Sonicator Cell Disruptor Model W-220F followed by treatment with 0.05 mol/L NaOH. Fraction recovered from chromatography of the spore-crystal complexes on column of Sephadex G-200 were assayed against mosquito larvae and the toxic fractions from gel chromatography were subjected to SDS-PAGE. The toxic proteins in B. sphaericus Ts-1 spore-crystal complex migrated in position corresponding to 42kD and 43kD. Bioassay of the two purified proteins prepared by PAGE indicated that they were all toxic to mosquito larvae. Toxic protein was further purified by DEAE-cellulose chromatography. The toxic protein with a molecular weight of 42kD was obtained.     

急诊胃癌穿孔腹腔镜手术方式选择的研究

目的:对急诊胃癌穿孔腹腔镜手术方式的选择进行探讨,为进一步优化治疗方案提供依据。方法:选取笔者所在医院2008年6月-2013年6月经治的21例胃癌穿孔临床资料作为研究对象,所有患者的病历资料完整,术式选择、并发症发生情况和术后存活时间进行分析。结果:21例均成功行腹腔镜手术。3例行单纯腹腔镜修补术,12例行经腹腔镜胃癌根治术(Ⅰ期7例+Ⅱ期5例),6例行姑息性远侧胃大部切除术(Ⅰ期5例+Ⅱ期1例)。结论:胃癌穿孔患者,全身情况较好可耐受全麻及腹腔镜根治性切除者,可积极行Ⅰ期腹腔镜根治行切除术。无条件者行穿孔修补术后2-3周再施行Ⅱ期经腹腔镜胃癌根治术。     

中国淫羊藿属药用植物花粉特征及其分类学意义

淫羊藿属(Epimedium L.)植物多为常用药材,分类和药材鉴定较为困难。该文采用扫描电镜对中国产淫羊藿属31种药用植物花粉的形态、大小和表面纹饰等进行了比较观察。结果显示:(1)淫羊藿属植物花粉形态多为长球形,少数为球形,大小为(15.5~25.0)×(27.3~48.1)μm,极面观多为三裂圆形,具三孔沟。(2)花粉粒外壁表面纹饰有网状、条网状、条纹状等类型。(3)花粉粒外壁纹饰如网眼的形状、大小和网脊表面特征等在各物种间有一定差异。研究结果为淫羊藿属药材鉴定与植物分类提供了重要的参考。     

水稻无侧根突变体RM109的显微结构及其根毛形态观察

水稻原品种"大力"以NaN3诱变方法获得了稳定突变体RM109.显微结构观察表明,RM109种子根外表根毛稀少且短小,无侧根发生,而"大力"品种则有侧根发生,且密生根毛.根毛观察比较显示,距种子根根端1 cm处的RM109根毛数是"大力"品种的19%,差异极显著,根直径与"大力"品种差异不显著;距根端8 cm处的RM109根毛数和根直径分别是"大力"品种的45%和79%,二者差异极显著;距根端3 cm处,RM109最大根毛长是"大力"品种的33%,差异极显著;RM109种子根根端到根毛发生区的长度,与"大力"品种的差异不显著.     

Asia-Ⅰ口蹄疫病毒P1-2A基因真核表达质粒的构建及小鼠免疫试验

目的 构建含有Asia-Ⅰ型口蹄疫病毒(FMDV)衣壳蛋白前体P1-2A 基因的真核表达质粒pVAXⅠ-P1-2A,并用pVAXⅠ-P1-2A免疫小鼠,评价其体液免疫和细胞免疫水平。方法 通过RT-PCR 方法扩增得到含有FMDV P1-2A编码区的目的基因,并将其克隆到pMD18-T载体上。将pMD18-T-P1-2A和 pVAXⅠ分别经EcoRⅤ和XbaⅠ双酶切后连接构建真核表达质粒pVAXⅠ-P1-2A。将酶切鉴定正确后的重组质粒转染HeLa细胞进行IFA检测。再进行小鼠血清特异性抗体试验、小鼠T淋巴细胞增殖试验和IFN-γ ELISPOT试验。结果 酶切结果与预期目的条带大小相符;荧光结果表明经pVAXⅠ-P1-2A转染的细胞有明显的黄绿色荧光,说明P1-2A基因在HeLa细胞中得到了表达;小鼠免疫结果表明,用免疫的小鼠都产生了较强的体液免疫和细胞免疫,并且T淋巴细胞增殖数和产生IFN-γ的细胞数和对照组相比显著提高(P<0.05)。间接ELISA试验表明,在免疫第14天抗体水平比对照组明显增高(P<0.05)。结论 成功构建了真核表达质粒pVAXⅠ-P1-2A,并通过小鼠免疫试验发现重组质粒试验组能够诱导产生特异性的体液免疫和细胞免疫应答。     

柔毛淫羊藿及其近缘种叶片非腺毛形态及其分类学意义

柔毛淫羊藿(Epimedium pubescens Maxim.)是中国淫羊藿属植物中分布较为广泛、形态变异较为丰富的物种,柔毛淫羊藿及其近缘种在分类中存在诸多争议。为研究柔毛淫羊藿及其近缘种变异规律和进行种的界限划分,该研究对柔毛淫羊藿31个居群和近缘种星花羊藿3个居群、镇巴淫羊藿1个居群、万源淫羊藿1个居群共36个居群的叶背非腺毛进行了显微观察。结果显示：(1)所观察到的非腺毛分为直毛、曲毛、伏曲毛、长伏毛、拟短伏毛、短伏毛、单细胞毛7个大类19个小类,并发现每个居群或每个个体的叶背面非腺毛是由多种类型构成。(2)共观察到13个居群具有乳突,且69.2%非腺毛较少(非腺毛密度少于50个/mm²)的居群具有乳突;而且共有27个居群中具有单细胞毛,占该研究36个居群的75%。(3)以非腺毛密度、主要类型构成进行居群归类,其中柔毛淫羊藿21个居群为直毛群(A),柔毛淫羊藿7个居群为曲毛群(B),柔毛淫羊藿2个居群、星花淫羊藿3个居群、镇巴淫羊藿1个居群为长伏毛群(D),柔毛淫羊藿1个居群为拟短伏毛群(E),万源淫羊藿1个居群为短伏毛群(F),所有居群均共有直毛类非腺毛,说明直毛类非腺毛为柔毛淫羊藿及其近缘种的核心类型非腺毛。(4)从居群内非腺毛类型组成的角度梳理出了居群间的演化关系,直毛群：AⅠ→AⅡ→AⅢ→AⅣ→AⅤ;曲毛群：BⅠ→BⅡ→BⅢ→BⅣ;长伏毛群：DⅠ→DⅡ→DⅢ;直毛群→曲毛群;短直毛群→短伏毛特化群;短直毛群→拟短伏毛特化群,且居群间的演化关系与地理分布呈现良好的相关性。(5)单细胞毛为淫羊藿属中首次发现。研究认为,单细胞毛可能与主流非腺毛类型(直毛和曲毛)和地理分布有关,但乳突则与叶背面的非腺毛密度可能存在负相关关系;该研究结果支持将星花淫羊藿归为柔毛淫羊藿种下等级的分类处理。     

云南松胚性愈伤组织诱导及增殖

以云南松成熟合子胚为外植体,在DCR培养基上诱导胚性愈伤组织,探索最佳消毒剂用量及激素浓度配比。用不同的培养方法增殖胚性愈伤组织,并对胚性愈伤组织形成过程中形态学与细胞学变化进行观察。其后提高培养基中肌醇浓度,增大渗透压,添加ABA,诱导早期原胚。结果表明,经5%次氯酸钠消毒20 min,使用添加8mg/L 2,4-D1、mg/L 6-BA、500 mg/L CH以及500 mg/L谷氨酰胺的DCR培养基接种,诱导率较高,可达70%以上;采用在愈伤组织周围添加少量培养过该愈伤组织的培养基的方式继代,愈伤组织增殖率可由20%显著提高至50%左右。在增殖培养基中添加4~6 mg/L ABA后,胚性细胞可逐渐发育形成胚性胚柄团。     

不同施肥处理对芳樟叶精油及其主成分芳樟醇含量的影响

为探讨不同施肥处理对芳樟(Cinnamomum camphora var.linaloolifera Fujita.)叶精油及其主成分芳樟醇含量的影响,运用三元二次回归正交旋转组合设计检测了不同N、P和K施肥条件下芳樟1年生扦插苗叶精油的含量和芳樟醇的相对含量并建立数学模型;通过对数学模型拟合的回归方程进行最优求解,确定最优施肥配比.结果表明:不同施肥处理对芳樟叶精油及芳樟醇相对含量的影响极显著,精油质量分数为1.53％ ～ 2.30％、芳樟醇相对含量为88.36％ ～ 94.87％.显著性分析结果显示:N和K施用量对精油含量分别有极显著和显著影响,N施用量对芳樟醇相对含量有显著影响而K施用量无显著影响,P施用量对精油含量和芳樟醇相对含量均无显著影响.N、P和K施用量与精油含量和芳樟醇相对含量数学模型的回归方程分别为Y=1.054+0.392X1-0.037X2 +0.280X3+0.014X1X2-0.022X1X3+ 0.018X2X3-0.057X12+0.001X22-0.053X32和Y=87.206 +2.802X1-0.279X2+ 1.115X3+0.180X1X2-0.147X1X3 +0.396X2 X3-0.525X12-0.137X22-0.275X32;据此计算出最优精油含量为2.22％,对应的N、P和K的每盆施用量分别为3.52、5.00和2.76 g;最优芳樟醇相对含量为95.18％,对应的N、P和K的每盆施用量分别为2.84、5.00和4.87 g.研究结果显示:N施用量对芳樟叶精油含量和芳樟醇相对含量的影响最大,最优精油含量和最优芳樟醇相对含量对应的施肥配比不完全相同,在生产中应根据生产目的并综合考虑各种环境因素确定合适的N、P和K施肥配比.     

不同年龄鼠骨髓干细胞移植治疗心梗后心衰的实验研究

目的：通过对比观察不同年龄鼠骨髓干细胞在体外的生长状态和移入受损心肌后对心肌梗死大鼠心功能的影响,说明年龄对骨髓干细胞的增殖能力和对移植效果的影响。方法：分别分离培养3日龄,1月龄,6月龄,12月龄Wister雄鼠骨髓干细胞,观察细胞生长状态,描记生长曲线。将60只大鼠用结扎冠状动脉前降支的方法制成心肌梗死模型后两周,随机分为三组：Ⅰ组：3日龄组（n=20只）：给予3日龄的5-溴脱氧尿嘧啶（Brdu）标记的鼠骨髓干细胞;Ⅱ组：6月龄组（n=20只）：给予6月龄的Brdu标记的鼠骨髓干细胞;Ⅲ组：对照组（n=20只）：给予培养液。各组均于治疗前及治疗后4周进行心脏超声检查评价心功能改善情况。处死动物取出心脏,进行直接测量后取左心室作石蜡切片,行苏木素-伊红（HE）染色及免疫组化检测,鉴定植入的细胞和心肌、毛细血管再生情况。结果：不同年龄鼠骨髓干细胞培养结果示3日龄及1月龄组增殖能力均高于6月龄及12月龄组,但3日龄与1月龄组之间无统计学差异,12月龄组在原代培养后期即死亡。治疗前超声心动图显示Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组心功能无显著差异（P〉0.05）,治疗之后四周超声心动图检查结果示：Ⅰ、Ⅱ组LVEF、FS、IVST、LVPW和LVESD较治疗前均有明显提高,且显著高于Ⅲ组;Ⅰ组LVEF、FS、IVST、LVPWs和LVESD又明显高于Ⅱ组;Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组LVEDD与治疗前比较无统计学意义。心脏直测结果显示Ⅰ、Ⅱ组的Wh、Wh、Wb、L、I度均较第Ⅲ组有所增加,其中Ⅰ组又明显高于Ⅱ组。免疫组化结果显示：Ⅰ、Ⅱ组于梗死周边均发现Brdu（＋）细胞存在,心肌特异性抗体阳性,且Ⅰ组阳性率明显高于Ⅱ组。毛细血管密度检测结果显示Ⅰ组毛细血管增生情况明显优于Ⅱ组。结论：不同年龄鼠骨髓干细胞的体外增殖能力不同,年龄越小,增殖能力越强。骨髓干细胞移植可以改善心肌梗死后大鼠的心脏功能,增加梗死区毛细血管密度,抑制心室重构,且年龄与移植效果成反比。