太平洋牡蛎i型溶菌酶基因的克隆与重组高效表达

在双壳类软体动物牡蛎体内,溶菌酶(Lysozyme)在实现宿主免疫防御,破坏和消除侵入体内的病原中发挥着重要的作用.根据GenBank已有的太平洋牡蛎溶菌酶的全长cDNA序列(GenBank:AB179775),通过RT-PCR技术,从太平洋牡蛎(Crassostrea gigas)中克隆得到溶菌酶(简称为CgLys)基因的开放阅读框(open reading frame,ORF)序列.生物信息软件分析表明,其ORF为414 bp,编码137个氨基酸(aa),前20个aa为信号肽,成熟肽由117个aa组成,其分子量为13.2 kD.通过构建分子系统发育树对其同源性进行分析比较,初步推断该CgLys属于i型溶菌酶.将该CgLys基因的成熟肽亚克隆进原核表达载体pET-32a(+)中,构建重组质粒pET32a(+)-CgLys,再转化至大肠杆菌BL21(DE3)pLysS.该基因工程菌经IPTG诱导发酵后,成功高效地表达了重组CgLys蛋白,其分子质量约为18 kD.该重组CgLya蛋白主要存在于细菌裂解液的上清液中,即以可溶性蛋白形式存在.上述结果将显著简化后续的蛋白纯化过程,为今后扩大规模生产牡蛎溶菌酶提供参考.     

海洋侧孢短芽孢杆菌的分离鉴定及其抗菌活性物质初步研究

采用滤纸片和牛津杯法对分离自大连海参养殖圈海水及海底污泥的506株细菌进行了抗菌活性筛选,获得了1株抗菌活性较强的菌株HS—A465。经形态观察及生理生化实验,结合16SrDNA序列分析,确定为海洋侧孢短芽孢杆菌（Brevribacillus laterosporus）。采用薄层层析和茚三酮显色检测,在其发酵上清液中存在2种具有较强抗菌活性的代谢物质,对每一种成分进行了分离纯化和抑菌实验。结果发现,成分2和3具有显著的抑菌作用。进一步分析表明,成分2和3还具有很强的热稳定性和pH稳定性,对有机溶剂耐受性较好。根据茚三酮显色结果,可以初步推断该活性物质结构上含有游离的氨基酸,初步推断它们是直链的肽类物质。这一研究成果将为海洋抗菌活性物质的进一步开发利用提供理论参考。     

链尿佐菌素加高糖高脂饮食复制大鼠2型糖尿病模型

目的链尿佐菌素加高糖高脂饮食诱导大鼠2型糖尿病模型的建立。方法SD雄性大鼠高糖高脂饲料喂养3周后,采血检测空腹血糖及血清胰岛素,按25mg/g体重剂量一次性腹腔内注射链尿佐菌素,3d后,行糖耐量实验,对糖耐量异常大鼠继续喂以高糖高脂饲料,在第2、第4周再两次采血检测糖尿病鼠空腹血糖及血清胰岛素。结果与对照组比较,高糖高脂喂养大鼠血清胰岛素明显上升（P〈0.01）,但血糖无变化（P〉0.05）,糖尿病鼠血糖及血清胰岛素均显著的高于对照组（P〈0.01）。结论高糖高脂喂养能致大鼠明显的高胰岛素血症,辅以小剂量一次性注射链尿佐菌素而造成的糖耐量异常,可成功复制出2型糖尿病大鼠模型。     

灌溉方式对稻田土壤微生物群落功能多样性的影响

为了探讨3种不同灌溉模式对土壤微生物群落功能多样性的影响。本研究采用Biolog-ECO板研究了双季稻田连续五年不同灌溉处理(长期灌溉,湿润灌溉,间歇灌溉)下的土壤微生物群落功能多样性。结果表明,不同灌溉方式处理的土壤微生物代谢活性强度为间歇灌溉湿润灌溉长期淹水灌溉。在不同的处理中,α-环式糊精和D-葡萄胺酸解释了主要的差异。氨基酸和糖类碳源是间歇灌溉和湿润灌溉灌溉模式下主要被利用的碳源,而酯类在长期淹水灌溉模式被利用的最多。通过评价3种灌溉方式下稻田土壤的代谢特征,证实了间歇灌溉方式有利于提高稻田土壤微生物的功能多样性,为稻田水分科学管理提供了理论依据。     

橡胶树白粉菌分支酸变位酶基因克隆及蛋白表达纯化

由橡胶树白粉菌引起的橡胶树白粉病是橡胶树的重要的叶部病害之一,严重影响橡胶的产量。然而目前对橡胶树白粉菌的致病机理研究匮乏。分支酸变位酶是莽草酸途径的关键酶,能够将分支酸转化为预苯酸,为植物提供氨基酸及大量代谢产物,在植物抗病中起到非常重要的作用。而植物病原物在致病过程当中能够分泌分支酸变位酶影响植物莽草酸途径,从而抑制植物的防卫反应。因此研究橡胶树白粉菌分支酸变位酶在其致病过程中的功能具有一定的意义。试验利用同源比对分析在橡胶树白粉菌基因组中获得一个分支酸变位酶同源蛋白,并用PCR克隆获得橡胶树白粉菌分支酸变位酶基因,命名为OHCmu。后续构建GST-OHCmu融合原核表达载体,筛选最优诱导条件,并利用GST亲和层析柱对蛋白进行纯化。结果表明橡胶树白粉菌OHCmu基因大小843 bp,具有1个内含子,编码263个氨基酸;具有d5csma_结构域,属于Chorismate mutaseⅡ蛋白家族;GST-OHCmu融合蛋白外源诱导表达在供试条件下(IPTG:0.8 mmol/L, 16℃)可以有较好的表达,获得融合蛋白大小约为56 kD。经过GST亲和层析柱纯化、切割GST标签后,顺利获得浓度较高、较纯的橡胶树白粉菌OHCmu蛋白。研究结果为后续OHCmu蛋白的特性及致病机理研究提供参考。