利用YADE法进行棉花基因组PCR步行

设计了一种依靠“Y”形接头延伸未知序列的方法（YADE,Y-shaped Adaptor Dependant Extension）,成功地抑制了在未知序列圹增中的单引物扩增。用这种方法从棉花基因组中扩增了一个棉花胚珠cDNA片段F027的相邻序列--FP27S和FP27A。重叠分析表明,F027S与F027有104bp的重叠,FP27A与F027有175bp的重叠。两个延伸片段分别含有1和3个可能的内含子,内含子均具有保守的边界序列GT-AG和与哺乳动物类似的分枝点序列。还对YADE法扩增未知序列的优缺点和可能的改进作了进一步讨论。     

一种基于PCR技术鉴定单拷贝转基因烟草的方法

为了鉴定携带单拷贝外源基因的转基因烟草植株,以烟草核基因组上已知的单拷贝内源基因（RNR2）为内参,转基因烟草植株基因组DNA为模板,在同一PCR反应体系中扩增内源基因（RNR2）和外源目的基因（NPTⅡ）。反应产物在琼脂糖凝胶上电泳,获得了预期大小的两条特异性扩增条带。经ImageJ软件捕捉分析两条目的条带的灰度比,当T1代转基因烟草植株中外源基因与内源基因的扩增条带灰度比为1时,所检测植株即为单拷贝外源基因的转基因烟草植株。孟德尔经典遗传学方法证实了上述检测结果高度可信。     

棉花GA 20-氧化酶基因转毛白杨的研究

以毛白杨为材料,研究了超量表达赤霉素合成酶基因(GA20-氧化酶基因)对毛白杨根、茎和叶的生长以及组织结构的影响,结果显示,表达GA20-氧化酶基因能显著提高毛白杨茎的生长,但是对根系的生长带来负面影响.同时,超量表达GA20-氧化酶基因促进了毛白杨茎木质部的生长,抑制了韧皮部和皮层的生长.研究结果表明GA20-氧化酶基因在毛白杨遗传改良中具有一定的应用价值.     

‘红阳’猕猴桃叶盘高频直接再生体系的建立

以‘红阳’猕猴桃雌株幼叶为外植体,直接诱导产生不定芽,并对不定芽增殖以及生根体系进行优化,建立了高频再生体系。结果表明,在MS+3.0 mg/L BA+1.0 mg/L NAA培养基中,不定芽诱导率达100％,平均出芽数达18.67个/叶盘;在MS+2.0 mg/L BA+1.0 mg/L NAA+0.1 mg/L GA3培养基中,增殖率达100％,1~6代不定芽平均繁殖系数达8.63;不定芽在1/2 MS+0.8 mg/L IBA培养基中培养15 d,然后继代至含1/2 MS液体培养基的珍珠岩中培养15 d,生根率达100％,且其根系发育良好;98株试管苗移栽到土壤盆钵中,成活95株,成活率达96.94％。本试验成功建立了红阳猕猴桃叶片高频直接再生体系,该体系诱导产生不定芽周期短,出芽率高,不定芽增殖系数大,生根率高且根系发达,为红阳猕猴桃试管苗的工厂化生产和遗传转化奠定了基础。     

毛白杨二次遗传转化体系的建立

为了建立有效的毛白杨二次遗传转化体系,优化了培养基激素配比、抗生素筛选浓度和乙酰丁香酮浓度.采用卡那霉素和潮霉素筛选,GUS组织染色和基因组DNA的PCR检测,通过二次遗传转化将GUS基因和潮霉素磷酸转移酶基因Hpt导入到毛白杨中,获得了60.7%二次转化频率.     

棉花类LRR抗病蛋白(GhLRR-RL)基因的克隆及表达分析

从棉花胚株的cDNA－AFLP片段中,选取一个与拟南芥类LRR抗病原因（LRR－RL）序列相似的片段,用RACE方法延伸其3′和5′未知序列,得到一个棉花类LRR抗病蛋白的全长cDNA序列（GenBank登录号：AY040532）。该cDNA长1259bp,包含一个987bp的开放阅读框,具有Poly（A）加尾信号。推测蛋白质包含329个氨基酸,其中大部分是LRR区,其序列符合膜外LRR的共有序列LXXLXXLXXLXLXXNXGXIPXX。序列和结构比例分析表明：该棉花LRR－RL蛋白与拟南芥的两个类LRR抗病蛋白高度同源,而与植物的其他LRR蛋白结构不同,推测LRR－RL蛋白属于一类新的LRR蛋白。斑点杂交和3′RACE扩增表明,棉花LRR－RL基因具有组成性表达的特点。     

油菜素内酯合成酶(Steroid 5α-Reductase)基因的超量表达对毛白杨生长的影响

将棉花Steroid 5α—reductase基因（DET2）超量表达载体导入毛白杨中,观察其对毛白杨生长和芽休眠的影响。结果表明,超量表达DET2基因的毛白杨茎高度、直径生长和不定根的生长增强,芽的休眠破除提前。     

超量表达IPT和KN1基因对转基因烟草生长发育的影响

为了比较异戊烯转移酶基因IPT和玉米homeobox基因KNI超量表达对植物生长发育的影响,将35S：：IPT和35S：：KNI分别导入烟草。观察发现,过量表达IPT和KNI基因对植株再生频率、形态、生长周期和顶端优势等方面的影响均相似,但在生根和开花结籽方面,35S：：IPT转基因植物所受影响更显著。细胞分裂素含量检测表明,35S：：IPT转基因植物叶片中细胞分裂素的含量高于35S：：KNI转基因植物。     

棉花Lea蛋白D-113基因启动子的克隆及序列分析

为研究植物Lea(late embryogenesis abundant）蛋白基因启动子在种子中的特异性表达,通过PCR扩增,从棉花（Gossypium hirsutum cv.Coker312）中克隆了Lea蛋白基因家庭中D-113基因上游1024bp的调控序列。DNA序列分析结果表明,该片段与已报道的Lea蛋白基因同一家庭该基因的对应序列同源性达90%以上。将将启动子序列与GUS基因融合,构建成表达载体后,通过基因抢轰击导入到经ABA诱导处理的棉花胚性愈伤组织和油菜种子以及棉花的根、茎、叶中,组织化学分析结果表明,D-113基因启动子在胚中特异性表达。     

应用CRISPR/Cas9技术在杨树中高效敲除多个靶基因

CRISPR/Cas9系统是一种广泛应用于细菌、酵母、动物和植物中的基因组定点编辑技术。本课题组在前期工作中利用该系统在毛白杨(Populus tomentosa Carr.)中率先实现了对内源基因—八氢番茄红素脱氢酶(Phytoene dehydrogenase, PDS)基因的定点敲除。为研究靶点的设计和选择对该系统介导的杨树内源基因敲除效率的影响,本文分析了不同单向导RNA(Single-guide RNA, sgRNA)结合毛白杨PDS(PtPDS)靶基因DNA序列后对突变效率的影响。结果发现sgRNA与靶基因间的碱基错配会导致突变的效率降低,甚至不能突变,其中3′端的碱基配对更为重要。进一步测序分析发现,该系统能同时敲除杨树基因组上两个同源的PDS编码基因(PtPDS1和PtPDS2),突变率分别达86.4%和50%。研究证明该系统可快速高效地敲除两个以上的内源基因,获得多重突变体杨树株系。利用该技术,本课题组已获得多个杨树转录因子及结构基因的敲除突变体株系,为将来开展基因功能研究和杨树遗传改良奠定了基础。