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为研究单增李斯特菌(LM)核糖核酸酶Rnase Ⅲ RncS氨基酸突变对RNA降解活性的影响。利用生物信息学软件分析单核细胞增生李斯特菌(LM)野毒株SB5中rncS基因编码的Rnase Ⅲ的结构域,并选择关键氨基酸利用基因重叠延伸PCR(SOE-PCR)技术对其进行了基因突变;然后将rncS突变基因片段D50A、E122A克隆至表达载体pET-32a(+),在大肠杆菌中利用IPTG进行诱导表达;应用SDS-PAGE和Western Blot鉴定重组蛋白的表达情况及其抗原特异性;通过体外酶活试验研究其对RNA降解活性的影响。结构域分析结果显示,LM-Rnase Ⅲ氨基酸序列含有1个双链RNA结合结构域(DSRM)和1个核酸酶结构域(RIBOc),其中结构域RIBOc含有5个活性位点。SDS-PAGE检测结果显示,表达的重组突变型Rnase Ⅲ -D50A和Rnase Ⅲ -E122 A蛋白相对分子质量均为42.5 kD,与理论值相符;Western blot分析表明重组突变型Rnase Ⅲ -D50A和Rnase Ⅲ -E122A蛋白可与LM阳性血清发生免疫学反应。体外酶活实验表明,Rnase Ⅲ发挥降解活性依赖于Mn2+或Mg2+,将其第50位天冬氨酸突变后,Rnase Ⅲ RncS的降解活性有所降低(P0.001);第122位谷氨酸突变后,Rnase Ⅲ RncS降解活性极显著下降(P0.0001),提示第122位谷氨酸是维持LM Rnase Ⅲ RncS酶活性的关键位点。 相似文献
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昆虫病原线虫共生细菌的代谢产物 总被引:16,自引:0,他引:16
昆虫病原线虫共生细菌寄生于昆虫病原线虫肠道内 ,二者互惠共生。该菌革兰氏染色阴性 ,属肠杆菌科 (Enterobacteriaceae) ,包含两个属———嗜线虫致病杆菌属 (Xenorhabdus)和发光杆菌属 (Photorhabdus)。其中嗜线虫致病杆菌与斯氏线虫 (Steinernema)共生 ,发光杆菌与异小杆线虫 (Heterorhaditis)共生。近几年 ,随着对共生菌研究的逐渐深入 ,发现共生菌能产生许多有应用潜力的代谢产物 ,如杀虫蛋白、抑菌物质、抗癌物质、胞外酶、胞内晶体蛋白、色素及荧光素等。特别是… 相似文献
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Cre重组酶结构与功能的研究进展 总被引:1,自引:0,他引:1
Cre/loxP定位重组系统来源于噬菌体P1,由Cre重组酶和loxP位点两部分组成。在Cre重组酶的介导下,设定的DNA片段可以被切除,可以发生倒位,亦可造成定点的整合。由于其作用方式高效简单,Cre/loxP定位重组系统已在特定基因的删除、基因功能的鉴定、外源基因的整合、基因捕获及染色体工程等方面得到了有效的利用,在转基因的酵母、植物、昆虫、哺乳动物的体内外DNA重组方面成为一个有力的工具。这里就Cre重组酶的结构、功能及该定位重组系统的应用等方面的研究进行了综述。 相似文献
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