转HSSP基因大豆的分子检测和遗传稳定性分析

HSSP是用大豆密码子改造的10 kD玉米醇溶蛋白基因。在前期研究中,从获得的转基因大豆中筛选到1份单拷贝转基因材料GSDH5。该研究采用染色体步移法获取转基因大豆GSDH5的T-DNA插入位点的左边界旁侧序列,对获得的左边界旁侧序列进行分析,设计特异性引物,建立转基因大豆GSDH5特异性检测方法;采用Real-time PCR检测外源基因在转基因大豆不同组织部位(根、茎、叶、花和种子)中的表达量,采用RT-PCR和Western blot检测外源基因在转录和翻译水平上的遗传稳定性,并对转基因大豆GSDH5中的粗蛋白、含硫氨基酸含量及主要农艺性状进行测定分析,为培育高含硫氨基酸转基因大豆新品种奠定基础。结果表明:(1)分子鉴定显示,外源基因HSSP和筛选标记基因Bar成功整合到受体大豆‘东农50’基因组中,且以单拷贝的形式整合到大豆基因组中。(2)HSSP基因成功插入到大豆基因组1号染色体非编码区52 873 883 bp处。(3)HSSP基因在转基因大豆GSDH5的种子中特异性表达,且在T_2～T_4代转基因大豆中能够稳定遗传并表达。(4)‘东农50’粗蛋白含量在41.53%～43.32%之间,GSDH5粗蛋白含量在40.18%～43.03%之间,两者相比无显著差异;GSDH5种子中硫氨基酸占种子干样的比例为1.35%,占种子蛋白的比例为3.14%,与转基因受体品种‘东农50’相比,占比显著升高,分别增加了11%和16%。(5)转基因大豆GSDH5植株与受体品种‘东农50’在单株荚数、百粒重、株高、结荚习性、花色、叶形等方面均无显著差异,证明HSSP基因的插入对大豆植株的生长发育无不良影响。研究认为,转基因大豆GSDH5材料具备进一步培育成高含硫氨基酸大豆新品种的潜力。     

真菌联合稀碱预处理杜仲叶提取杜仲胶的工艺研究

以杜仲干叶为原料,经稀碱和绿色木霉联合处理以除去杜仲表面覆盖的角质层,同时洗脱一些可溶性杂质,并且破坏杜仲叶的细胞壁与纤维结构,再以石油醚作为提取溶剂,得到粗胶再经丙酮浸洗获得杜仲精胶。用0.45%NaOH在75℃下除去杜仲叶表面的角质层,并且同时脱除一些可溶性活性成分(如:多糖、黄酮类、京尼平苷等),之后得杜仲叶干燥,利用绿色木霉去破坏杜仲叶的细胞壁与纤维结构,在85℃条件下以石油醚作为提取溶剂提取杜仲胶。最后,经测得未处理前杜仲叶中的杜仲胶的含量为1.78%,0.45%NaOH稀碱预处理后含量为3.16%,绿色木霉发酵后含量为4.36%。预处理前,有机溶剂一次提取率为0.73%,纯度为83.7%。稀碱与真菌联合预处理后一次提取率为2.85%,纯度为96.6%。本工艺以稀碱与绿色木霉共同作用,减少了有机溶剂的用量,与传统工艺相比,更加的绿色环保,安全有效,为杜仲胶的提取提供了科学有效的依据。     

CRISPR筛选在生命医学研究中的应用

CRISPR/Cas9是一种高效、便捷的基因编辑工具,在生命科学领域具有广泛的应用。基于CRISPR/Cas9系统构建基因组文库进行高通量筛选,有助于解析不同生物学背景下编码基因的功能和调控元件的特征。覆盖全基因组或特定生物途径的CRISPR筛选支持在不同的遗传背景和时空环境下进行,有助于鉴定关键的生物学靶点,并阐述生理、病理条件下的基因功能及相互作用网络。本文总结了近年来CRISPR筛选在衰老、肿瘤等疾病研究中的重要进展,概述了CRISPR筛选与单细胞测序、功能基因组学等方法相结合的研究策略,并讨论了CRISPR筛选面临的挑战以及可能的解决方案。     

意大利蜜蜂工蜂幼虫肠道中ame-miR-bantam对靶基因USP和P300的表达调控

【目的】本研究旨在通过饲喂法对意大利蜜蜂Apis mellifera ligustica工蜂幼虫肠道中ame-miR-bantam进行过表达与敲减,明确ame-miR-bantam对靶基因USP和P300表达的调控作用。【方法】通过饲喂ame-miR-bantam模拟物(mimic-ame-miR-bantam)和抑制物(inhibitor-ame-miR-bantam)及相应的阴性对照mimic-NC-ame-miR-bantam和inhibitor-NC-ame-miR-bantam,对意大利蜜蜂工蜂4-6日龄幼虫肠道组织中的ame-miR-bantam分别进行过表达和敲减。利用生物信息学软件进行ame-miR-bantam的靶向预测及分析。通过RT-qPCR检测4-6日龄意大利蜜蜂工蜂幼虫肠道中ame-miR-bantam的过表达和敲减效果及靶基因USP和P300的相对表达量。【结果】相较于饲喂mimic-NC-ame-miR-bantam,饲喂mimic-ame-miR-bantam后,ame-miR-bantam在意大利蜜蜂4-6日龄工蜂幼虫肠道中均显著上调;相较于饲喂inh...     

桃花粉育性与花药颜色的关系及其SSR分子标记

以李属桃亚属的637份桃品种种质和栽培种瑞光19×Summergrand杂交的138株F1群体为试材,对桃花粉育性与花药颜色的关系及其SSR分子标记进行研究。结果表明:在所有品种中,橘红花药最多,占总份数的91.2%,其中绝大部分花粉可育;橘黄和黄色花药的种质数量次之;白色和浅褐花药的种质最少,且均表现为花粉不稔;整体表现为红色和黄色花药与花粉可育具有较强的正相关性。本试验从122对SSR引物中筛选出2对与花粉育性性状连锁的标记CPDCT013和CP-SCT012,根据这2个标记参考整合参考图谱的位置,将控制花粉育性的基因定位在桃第6条染色体上端。对已经报道的2个桃花粉育性标记CPPCT004和NNJ-I以及第6条连锁群的其他SSR位点在花粉育性不同的24个品种上验证,结果表明只有UDP96-001(125bp)可以用于桃花粉育性的分子标记辅助育种。     

ame-miR-79负调控意大利蜜蜂工蜂幼虫肠道中靶基因CYP450和FG的表达

【目的】本研究旨在通过饲喂ame-miR-79的模拟物(mimic)和抑制物(inhibitor)对意大利蜜蜂Apis mellifera ligustica工蜂幼虫肠道内的ame-miR-79分别进行过表达和敲减,探究ame-miR-79对幼虫肠道内靶基因表达的调控作用。【方法】通过分子克隆与Sanger测序验证意大利蜜蜂工蜂幼虫肠道内ame-miR-79的序列真实性。通过饲喂mimic-miR-79和inhibitor-miR-79对意大利蜜蜂工蜂4-6日龄幼虫肠道内的ame-miR-79分别进行过表达和敲减。采用相关生物信息学软件进行ame-miR-79的靶基因预测与分析。通过RT-qPCR检测ame-miR-79的过表达和敲减效果及过表达和敲减ame-miR-79后靶基因的相对表达量。【结果】ame-miR-79在意大利蜜蜂工蜂幼虫肠道内真实存在。与无义模拟物(nonsense mimic, mimic-NC)组相比,mimic-miR-79组的4-6日龄幼虫肠道内ame-miR-79的表达量皆极显著上调;与无义抑制物(nonsense inhibitor, inhibitor-NC)组相比,inhibitor-miR-79组的4和5日龄幼虫肠道内ame-miR-79的表达量显著下调,6日龄幼虫肠道内ame-miR-79的表达量极显著下调。ame-miR-79共靶向303个基因,涉及27个GO条目和179条KEGG通路。相较于mimic-NC组,靶基因细胞色素P450基因CYP450在mimic-miR-79组的4和5日龄幼虫肠道内均极显著下调表达,而在6日龄幼虫肠道内上调表达;靶基因fringe糖基化转移酶(fringe glycosyltransferase, FG)基因在4日龄幼虫肠道内下调表达,在5日龄幼虫肠道内显著下调表达,而在6日龄幼虫肠道内上调表达。相较于inhibitor-NC组,CYP450在inhibitor-miR-79组的4日龄幼虫肠道内极显著上调表达,在6日龄幼虫肠道内上调表达,而在5日龄幼虫肠道内下调表达;FG的表达水平在4日龄幼虫肠道内显著上调,在5和6日龄幼虫肠道内极显著上调。【结论】ame-miR-79在意大利蜜蜂工蜂幼虫肠道内真实存在;通过饲喂模拟物和抑制物能分别实现意大利蜜蜂工蜂幼虫肠道内ame-miR-79的有效过表达和敲减;ame-miR-79负调控意大利蜜蜂工蜂幼虫肠道内CYP450和FG的表达。     

小儿阵发性室上性心动过速37 例临床分析

目的:对比研究和评价不同方法治疗小儿阵发性室上性心动过速(PSVT)的的疗效,提高转复率。方法:回顾性分析2002.04-2011.05我院住院治疗的37例PSVT患儿的临床资料,并分析比较心律平与胺碘酮的药物转复率,构成比采用x2检验,α=0.05。结果:37例患儿中,13例治疗原发病后自动转率,24例患儿给予心律平治疗,其中1例放弃治疗,5例未见效,心律平转复率为69.77%,5例未见效患儿改用胺碘酮治疗,1例死于原发病,1例控制症状后行射频消融术治愈,胺碘酮转复率为75%,二者之间无显著差异性。结论:心律平与胺碘酮均能较好的治疗小儿PSVT,对于反复发作,药物治疗无效的小儿PSVT,射频消融术已成为最佳选择。     

不同灌水上限和施肥量对温室番茄产量与品质的影响

以番茄品种‘英石大红’为材料,在滴灌施肥种植条件下进行日光温室栽培试验;灌水上限设3个水平,即土壤相对含水量分别为田间最大持水量的70%(W₁)、80%(W₂)、90%(W₃),灌水下限统一设定为田间最大持水量的50%;N、P、K施肥设3个水平,分别为低肥F₁ ［N(228 kg/hm²)、P₂O₅(132 kg/hm²)、K₂O(300 kg/hm²)］、中肥F₂ ［N(285 kg/hm²)、P₂O₅(165 kg/hm²)、K₂O(375 kg/hm²)］和高肥F₃ ［N(342 kg/hm²)、P₂O₅(198 kg/hm²)、K₂O(450 kg/hm₂)］,以大水漫灌(8165 m³/hm²)、当地推荐施肥量(342 kg/hm² N、198 kg/hm² P₂O₅、450 kg/hm² K₂O) 组成共同水肥对照(CK),探讨不同灌水上限和施肥量处理组合对番茄产量、品质和干物质量的影响,以筛选日光温室栽培番茄的最佳灌水上限和施肥量组合。结果显示：(1)在水肥一体化条件下,番茄植株的地上部干鲜重、地下部干鲜重、根冠比除F₃W₁处理外均显著高于传统水肥CK。(2)番茄果实产量在不同灌溉上限和施肥量处理下表现各异,其中在F₂W₂处理下番茄果实单果重、经济产量、生物产量达到最高,且与CK差异显著。(3)在同一灌水上限条件下,在一定范围内增加施肥量可以显著提高番茄果实的可溶性糖、维生素C、可溶性蛋白、番茄红素含量,而番茄果实有机酸和硝酸盐含量随施肥量的增加而不断增加;在同一施肥量条件下,番茄果实有机酸含量随着灌水上限的上调而不断减少,而番茄果实硝酸盐含量却随着灌水上限的上调而不断增加。研究发现,在滴灌施肥条件下合理控制温室番茄的灌水量与施肥量能够显著增加番茄产量以及番茄果实中可溶性糖、维生素C、可溶性蛋白、番茄红素、有机酸等含量,降低硝酸盐含量,增加干物质积累量;在灌水上限为田间最大持水量的80%、灌水量为3 686.691 m³/hm²,施肥量为285 kg/hm² N、165 kg/hm² P₂O₅、375 kg/hm² K₂O是最佳水肥处理组合,且番茄产量可以比传统水肥处理显著增加15.03%,果实品质同时得到有效改善。     

功能区胶质瘤患者初级运动皮层激活的偏侧化及运动网络功能连接研究

无运动障碍的功能区胶质瘤患者,其手术风险较高,结合手运动任务态功能磁共振(fMRI)及运动网络功能连接能否更准确的评估手术风险需要进一步探索.本研究收集24例运动功能区胶质瘤且无明显肢体运动功能障碍的患者,非运动功能区胶质瘤患者8例,术前进行fMRI手运动任务态及静息态检查,术后3个月对患者进行随访.计算初级运动皮质(M1)激活的偏侧化指数(lateralization indices,LI).选取运动网络感兴趣区域(ROI),计算双侧M1与各ROI间功能连接系数(FC).运用受试者工作特性曲线(receiver operating characteristic curve,ROC)评估M1激活的LI对术后偏瘫的预测效能.同非运动功能区胶质瘤患者相比,运动功能区胶质瘤患者M1激活LI显著升高(P=0.001).同术后未偏瘫功能区胶质瘤患者相比,术后偏瘫患者M1激活LI值显著升高(P=0.011).ROC曲线下面积(AUC)=0.867,临界点LI=0.31,LI≥0.31对术后偏瘫预测灵敏性为87.5%,特异性为87.5%.以M1激活LI≥0.31将病人分为手术高风险组及低风险组,手术高风险组患者双侧M1与运动网络多个ROI间FC出现显著改变.本研究中功能区胶质瘤患者虽无肢体运动功能障碍,但肿瘤对功能区皮层激活及运动网络FC已有不同程度的破坏;结合任务态及静息态fMRI可以更好地评估手术风险并了解机体功能受损及代偿机制.     

番茄果实转录因子CNR的原核表达与纯化及其抗体的制备

转录因子CNR(Colourless non-ripening)在果实的发育和成熟过程中起重要作用。目前关于番茄转录因子CNR的研究主要集中在转录水平,然而蛋白水平才是CNR发挥作用的水平。通过对CNR进行原核表达和纯化,并制备CNR的多克隆抗体,在蛋白水平上确定番茄转录因子CNR的表达模式。结果表明:pET-CNR重组载体具有正确的读码框,且与已发表的番茄CNR编码序列完全一致,并且在27 kD处有CNR蛋白表达,证明pET-CNR原核表达载体构建成功。诱导剂IPTG的最适宜浓度为1.0mmol/L,当用咪唑浓度为500 mmol/L的洗脱缓冲液洗脱层析柱时得到单一的CNR蛋白,并以此作为抗原免疫小鼠,制得效价高且特异性好的CNR蛋白多克隆抗体。最后研究不同成熟时期番茄果实CNR蛋白的表达模式,结果发现转录因子CNR在番茄果实的破色期起重要作用。