非洲猪瘟病毒多基因家族研究进展

非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)感染引起的一种急性、热性、高度接触性、致死性动物传染病.由于ASFV基因组庞大,变异能力强,免疫逃逸机制复杂,至今无有效药物和疫苗.近年来,对多基因家族的研究取得了很大的进展,可变区多基因家族拷贝数变化是导致ASFV变异的主要原因,且陆续发现多基因家族在决定细胞宿主范围、影响病毒毒力强弱、抑制Ⅰ型干扰素信号通路、抑制干扰素抗病毒效应和促进病毒蜱源感染中具有重要作用.本文对当前的ASFV多基因家族研究进展进行总结,阐述其在基因变异和病毒感染中的作用,以期为非洲猪瘟免疫逃逸机制的探索和疫苗的研发提供理论依据.     

猪细小病毒VP2蛋白N端甘氨酸富集区的缺失对病毒样颗粒形成及免疫原性的影响

猪细小病毒(PPV)VP2蛋白N端连续9个甘氨酸富集的编码区是VP3蛋白的切割位点,常规PCR扩增容易导致该区段的缺失,为研究该缺失对PPV病毒样颗粒(VLPs)的影响,探索VP2病毒样颗粒上适合外源基因插入的位点,构建了该区段缺失的VP2的真核表达载体pCI-△VP2,并以完整VP2作为对照,采用脂质体介导法转染Vero细胞,通过生物信息学技术、SDS-PAGE、Western blotting、间接免疫荧光以及正染和免疫电镜对表达产物进行分析观察;进一步将重组质粒以核酸疫苗的方式直接肌注免疫小鼠,采用间接ELISA试验、淋巴细胞增殖试验和T细胞亚群流式细胞技术,分析免疫小鼠的体液和细胞免疫应答.结果显示,缺失△VP2和完整VP2在Vero细胞中均能自我装配成VLPs,并具有与完整病毒粒子类似血凝性,pCI-△VP2和pCI-VP2均可诱导小鼠产生较强的特异性体液免疫应答和良好的细胞免疫应答.结果表明,甘氨酸富集区的缺失不影响VP2病毒样颗粒的装配和免疫原性,△VP2同样可进行PPV VLPs疫苗和抗原转运载体的研制,为VLPs载体改造和修饰位点的探索提供了新方向,为VP2基因结构与蛋白质功能的关系提供了新的理论依据.     

人工接种猪瘟病毒对猪外周血白细胞的影响

为研究CSFV强毒感染对猪外周血白细胞的影响,本研究用猪瘟病毒石门株(CSFV SM)感染60日龄仔猪后,分析外周血中CSFV核酸载量动态变化、白细胞亚群变化和白细胞SLAⅠ和SLAⅡDR分子的表达情况。实验结果显示:实验仔猪经CSFV感染后48小时体温升高并可以在血液中检测到CSFV核酸,核酸载量持续升高,在感染后6日(DPI)达到最大值,为2 DPI时核酸载量的104.84±0.98倍;WBC、LYM、PLT数量持续降低,WBC在1DPI和2DPI分别降至65.87%和50.00%,LYM在1~3DPI分别降至70.68%、47.88%和23.29%,PLT数量持续降低,6DPI时仅为初始值的34.59%;NK、γδT、Tc、Th、CD3+CD4+CD8+和CD3-CD4-CD8-淋巴细胞在感染后均不同程度的减少,其中NK细胞在1DPI时减少78.49%,而后变化与1DPI比较差异不显著,γδT、Tc、CD3-CD4-CD8-、CD3+CD4+CD8+在3DPI时分别降至41.74%、43.83%、15.87%和32.96%,Th细胞在感染后持续下降,在6DPI时减少至42.95%;感染后淋巴细胞中表达S...     

猪链球菌2型感染仔猪致脑炎模型的建立

【背景】猪链球菌2型(Streptococcus suis type 2)是危害养猪业重要的病原,给我国养猪业造成了重大的损失,迄今为止仍缺乏猪链球菌2型感染仔猪致脑炎模型,建立合适的模型用于临床药物研发及机制研究为防控该病奠定基础。【目的】构建猪链球菌2型感染仔猪致脑炎模型,通过观察感染仔猪的临床变化、病理学变化、病原分离及PCR鉴定证实模型构建成功。【方法】选取6头健康的三元杂交猪仔猪,随机均分为A、B两组。A组仔猪接种猪链球菌,B组接种生理盐水作为空白对照,观察A组仔猪的临床症状、剖检变化、病理组织学变化。【结果】A组仔猪出现体温升高、精神沉郁、嗜睡以及严重的神经症状,甚至死亡;器官出现严重病变,如脊髓和大脑的神经元细胞的肿胀、坏死、溶解,小脑灰质区浦肯野细胞层和颗粒层见细胞灶状坏死并形成坏死后空腔。【结论】成功构建出猪链球菌2型感染仔猪的脑炎模型。     

猪霍乱沙门氏菌递送的双启动子表达载体的构建

猪霍乱沙门氏菌C500株不仅可以作为预防猪沙门氏菌病的活疫苗,还可作为运送其他DNA疫苗的优良载体,并通过粘膜免疫诱导产生针对特定抗原的各种免疫应答。为增强其携带的DNA疫苗的免疫效力,本研究以真核表达载体pEGFP-C1为基础,将其真核启动子CMVie与原核启动子Ptrc串联,并在其多克隆位点MCS下游引入rrnbT1T2转录终止序列,构建了真、原核双启动子表达载体pEGFPPtrcR。用1×TSS法将其转化C500,得到工程菌C500/pEGFPPtrcR,通过SDS-PAGE和Westernblotting鉴定了报告基因EGFP的原核表达,该菌在荧光显微镜下能发出强烈绿色荧光,被证明在体外至少能稳定遗传20代;采用脂质体介导法将pEGFPPtrcR转染Vero细胞,EGFP在胞核和胞浆内表达,24h后观察可到明显绿色荧光。结果表明,双启动子表达载体pEGFPPtrcR构建成功,预示其携带的外源基因既可在C500中表达,又可在体细胞中表达,为研制以C500为载体的新型DNA疫苗的发展开辟了一个新的途径。     

表达猪流行性腹泻病毒S1基因植物乳酸杆菌工程菌的免疫原性分析

为探究表达猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV) S1基因的植物乳杆菌工程菌是否对动物产生保护力,利用构建的含重组质粒pVE5523-S1乳杆菌口服免疫豚鼠3次,每次间隔14 d,每次2×108 CFU/只。并以植物乳杆菌及含表达质粒pVE5523植物乳杆菌为阴性对照,进行相同处理。用猪流行性腹泻、猪传染性胃肠炎二联活疫苗(HB08株+ZJ08株)肌肉注射接种豚鼠,免疫3次,每次间隔14 d,每次0.2 mL/只,作为阳性对照。分别在免疫后的0 d、7 d、14 d、24 d、31 d、41 d及48 d对4组试验豚鼠心脏采血并分离血清,进行酶联免疫吸附试验(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测抗体和中和试验分析,同时无菌采豚鼠脾脏,进行脾细胞增殖实验分析。结果显示,工程菌能刺激机体产生分泌性抗体sIgA、特异性中和抗体,还可刺激机体IL-4和IFN-γ的增长以及脾细胞的增殖。说明该PEDVS1基因植物乳杆菌工程菌使豚鼠对PEDV产生了特异性免疫力,为后续口服疫苗的研究奠定了基础。     

重组大熊猫IFN-γ聚氰基丙烯酸正丁酯纳米球的制备与评价

为了制备并评价大熊猫(Ailuropoda melanoleuca)重组干扰素γ(IFN-γ)聚氰基丙烯酸正丁酯(PBCA)纳米球,本研究利用蛋白质原核表达技术,获得了重组大熊猫IFN-γ蛋白,然后以PBCA为载药材料,采用乳化聚合法制备了大熊猫干扰素γ纳米微球(IFNγ-PBCA-NS),最后借助感染大熊猫流感病毒A/Panda/Sichuan/01/2011(H1N1)的昆明小鼠(Mus musculus)模型,通过灌胃和皮下注射药物初步评价了IFNγ-PBCA-NS的药效。结果表明,大熊猫IFN-γ的蛋白分子量约为33.5 ku,所制备的大熊猫IFNγ-PBCA-NS外观规整,粒径在50~200 nm之间,跨距0.55,大小较均匀,包封率为56.7%,载药量为0.86%。灌胃和注射两种给药途径中,IFNγ-PBCA-NS组小鼠的生命延长率均显著高于IFN-γ组(P0.05或P0.01)。显示IFNγ-PBCA-NS在小鼠体内有更好的缓释和抗病毒作用,可为进一步研究制备大熊猫多肽类药物微粒提供参考。     

猪塞内卡病毒病原学研究进展

2014年以来,巴西、美国、中国、泰国等多个国家相继暴发了塞内卡病毒（Senecavirus A,SVA）疫情,且流行范围呈扩大趋势,SVA逐渐成为研究和关注的热点。本文主要从SVA病毒蛋白结构功能、入侵机制、适应性免疫反应及免疫逃逸等方面对SVA相关病原学研究进行综述,以期为进一步开展猪SVA的致病机制研究以及疫苗研发提供帮助。     

致病性大肠杆菌和蜡样芽胞杆菌的分离鉴定

【背景】猪只消化道疾病是养猪业上一大重要疾病,给养猪业带来一定的经济损失。大肠杆菌是引起猪腹泻的一种常见病原菌,可以引起不同日龄的猪腹泻,但主要以幼龄猪为主。【目的】旨在分离鉴定引起四川省眉山市一规模化养猪场病猪大规模腹泻的病原菌。【方法】采用常规细菌分离方法结合16S rRNA基因序列的分析方法从发病猪肝脏、胃以及污染的饲料分离鉴定细菌,并对分离株进行小鼠致病性试验、16S rRNA基因遗传进化树分析、毒力基因的检测、药物敏感试验。【结果】从腹泻猪肝脏中分离到一株致病性大肠杆菌,胃中分离到一株蜡样芽胞杆菌,并且追溯到传染源是该猪场饲料。通过检测这两株菌相应的毒力基因发现大肠杆菌不属于肠外致病性型,蜡样芽胞杆菌检测到了nheA、nheB、nheC、bceT、entFM 5种毒力基因;药敏试验表明常规的氨基糖苷类和头孢类抗生素对大肠杆菌抑菌效果较好,红霉素、氟苯尼考、头孢氨苄、头孢哌酮对蜡样芽胞杆菌抑菌效果较好,而蜡样芽胞杆菌对青霉素、阿莫西林等常规药物不敏感。【结论】饲料存在大肠杆菌和蜡样芽胞杆菌的混合污染。