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白蛋白融合α-2b干扰素在毕赤酵母中的表达 总被引:7,自引:0,他引:7
α2b干扰素的重组表达质粒pPIC9KHSAIFNα2b经限制性内切酶SalI酶切线性化后电转化巴斯德毕赤酵母菌(P.Pastoris)SMD1168,将阳性转化子进行PCR鉴定和Mut表型鉴定并用甲醇诱导表达,WesternBlot结果表明白蛋白融合IFNα蛋白与IFNα抗体具有结合能力,Wish细胞VSV病毒系统鉴定表达蛋白具有抗病毒生物活性。在摇瓶培养条件下,甲醇在0.5%~4.0%的范围,随着浓度的升高蛋白表达量也升高,在其他因素固定时,菌体起始OD值在5~80的范围内,随着OD值的升高表达量反而下降。成功表达出具有高生物学活性的白蛋白融合干扰素蛋白(HSAIFNα2b),为进一步应用打下基础。 相似文献
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基因工程蛋白下游纯化技术研究进展范清林桂向东吴清发魏跃武宋礼华(安徽省生物研究所,合肥230031)自从1972年首次发现核酸内切酶,并在同年完成了世界上第一次成功的DNA体外重组实验以来,基因工程技术在二十多年的历程中经历了飞速的发展。我国在八十年... 相似文献
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DNA shuffling技术可以定向进化干扰素,获得比rhIFN-α2b标准品更高比活的干扰素.rhIFN-α2b基因与Infergen基因用DNaseI酶切成30-50 bp小片段,回收之后进行无引物PCR 重聚和有引物PCR扩增基因.将重组基因连接到载体pUC19中,转化至DH5α并挑选阳性克隆测序.将测序正确的突变基因连接到载体pET30a中并转化至BL21(DE3)中,然后诱导蛋白表达、SDS-PAGE凝胶电泳和Western blot分析.经过表达细胞诱导、细胞裂解、包涵体变性、复性和单克隆抗体亲和层析之后,获得高纯度的重组干扰素.经测定纯化后的重组干扰素比活达到5.8×108IU/mg,比rhIFN-α2b标准品高出5倍左右.实验结果证明此实验方法对提高干扰素的比活是有效的,可以获得比标准品更高比活的干扰素. 相似文献
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利用PCR技术构建RGD短肽与人肿瘤坏死因子凋亡配体(胞外区114-281)的融合基因,将该DNA片段克隆到原核表达载体pET-11a中。重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导后可表达相对分子质量约为20000的目的蛋白,占菌体蛋白的20%左右,且大多数重组蛋白以不溶的包涵体形式存在。Western印迹表明目的蛋白具有人sTRAIL的抗原性。表达产物经变性、复性、离子交换层析和分子筛等步骤,可以得到纯度大干95%的RGD-sTRAIL重组蛋白。肿瘤细胞体外实验发现,纯化后的RGD-sTRAIL重组蛋白能明显抑制人肺癌细胞A549生长,并呈剂量依赖性。研究结果表明,通过复性,包涵体中的RGD-sTRAIL蛋白得到正确的折叠,并在体外具有杀伤肿瘤细胞的活性,从而为进一步研究体内靶向性杀伤肿瘤细胞奠定了基础。 相似文献
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毕赤酵母表达系统在外源蛋白表达中的研究及应用 总被引:10,自引:1,他引:9
巴斯得毕赤酵母(Pichia pastoris)表达系统作为一个日臻完善的外源蛋白真核表达系统由于它所具有的一些其它表达系统不可比拟的优势而得到越来越广泛的应用。分别从该表达系统的优点、外源基因整合及调控机理、表达蛋白糖基化及翻译后修饰等方面综述了其在外源蛋白表达中的研究进展及应用。 相似文献
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研究重组人白蛋白干扰素α-2b融合蛋白(rHSA-IFNα-2b)的稳定性.以抗病毒活性和纯度为主要检测指标,考察rHSA-IFNα-2b的热稳定性,酸碱稳定性以及冻融耐受性.rHSA-IFNα-2b在37℃、55℃下放置5h后生物学活性无明显降低,60℃水浴lh即可见活性降低了约40%;pH值(分别为2、3、9)改变时,生物学活性未发生明显变化;rHSA-IFNα-2b反复冻融后聚合体逐渐增加,冻融4次后聚合体含量达到17.91%,但生物学活性无明显降低.重组人白蛋白干扰素α-2b融合蛋白对热、酸碱变化稳定,但不宜冻融. 相似文献
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