腺病毒介导的uPAR反义核酸转移抑制肿瘤细胞的侵袭

为了观察尿激酶受体(uPAR)反义核酸对肿瘤细胞体外侵袭的抑制作用,用PCR方法扩增uPAR cDNA 5′端－46 bp～＋454 bp一段长500 bp的序列,利用DNA重组技术将其克隆到病毒载体pAdeno-X中, 构建出重组腺病毒载体pAdeno-X-uPAR(－)和pAdeno-X-uPAR(+).线性化后的重组腺病毒载体转染HEK293细胞7天后,可以获得滴度分别为1.5×10⁸ pfu/ml和0.5×10⁸ pfu/ml的uPAR反义和正义核酸表达重组腺病毒,分别命名为Ad-uPAR(－)和Ad-uPAR(+).以不同的病毒感染指数（MOI）感染人肺巨细胞癌高转移株95D肿瘤细胞,3天后用RNA印迹法可以检测肿瘤细胞uPAR正义和反义核酸表达水平,随着MOI的升高,Ad-uPAR(－)感染的肿瘤细胞uPAR蛋白水平逐渐下降,肿瘤细胞的体外侵袭能力也明显下降,而感染Ad-uPAR(+)的肿瘤细胞无明显变化.结果表明,重组腺病毒可以表达uPAR正义和反义核酸,uPAR反义核酸可以明显抑制人肺巨细胞癌高转移株95D肿瘤细胞在体外的侵袭能力.     

HeLa细胞中与组织型转谷氨酰胺酶相互作用蛋白质的筛选

组织型转谷氨酰胺酶 (tissuetransglutaminase ,tTG ,TGII)是转谷氨酰胺酶家族成员之一 ,多数细胞凋亡过程中均有tTG表达水平的升高。为研究tTG在细胞凋亡过程中发挥作用的机制 ,利用Gal 4酵母双杂交系统筛选了HeLa细胞中与tTG相互作用的蛋白质 ,获得了 17个阳性酵母克隆。序列测定显示其中 1个克隆所含cDNA序列编码TIA 1相关蛋白 (TIA 1 relatedprotein ,TIAR )C端 12 9个氨基酸残基序列 ,GST下拉 (pull down)实验也证实tTG与TIAR能相互作用 ,而且这种相互作用需要Ca2 参与作用。这些结果提示tTG可能通过其Ca2 依赖的转谷氨酰胺活性对TIAR进行修饰从而影响TIAR的功能 ,可能在细胞凋亡中发挥着一定的作用。     

介绍一种新的电泳技术——蛋白质的硝酸纤维纸转移电泳

硝酸纤维纸转移电泳首先应用于DNA片段的研究中,其原理是把琼脂糖凝胶电泳后分离的DNA各片段,再一次,转移到硝酸纤维纸上,然后在纸片上进行DNA-RNA杂交等实验。由于Southern最先报道,转移过程又类似于把墨迹吸到吸墨纸上,故称Southern Blot。此后Alwine等又把它应用到RNA的研究上,称为Northern Blot。Towbin等又扩展到蛋白质研究中,取名为Western Blot。最近Reinhart等将等电聚焦电泳后的蛋白质转移到硝酸纤维纸,称为Eastern Blot。这种方法为蛋白质检测提供了方便,也扩大了凝胶电泳技术的应用范围。本文综合国外的报道,并结合     

脂肪酸合成酶的结构与功能

动物和酵母两者的脂肪酸合成酶都是多功能酶复合物。动物脂肪酸合成酶由完全相同的多功能亚基组成,每个亚基虽然都含有从头至尾合成脂肪酸的全部酶系,但活性单位是以“头”“尾”并列的二聚体形式,每次同时进行两个软脂酸的合成与释放。酵母脂肪酸合成酶则由两种不同的多功能亚基组成,活性单位是六聚体形式,并能同时进行六个软脂酰的合成与释放。另外,脂肪酸合成酶的含量和活性还受一些代谢物、激素和药物的影响。     

干扰素调节因子-3的分子结构和磷酸化

干扰素调节因子3(IRF-3)是一种转录因子,它能对干扰素(IFN)的基因表达进行调控。它的激活是通过一系列位点的磷酸化来完成。近年来,人们对IRF-3的磷酸化调节进行了大量的研究,本文就以上研究进展作一综述。     

大鼠丙酮酸激酶同工酶催化性质的比较研究

利用DEAE纤维素柱层析分离大鼠组织匀浆105,000g上清中的丙酮酸激酶(PyK)同工酶,发现肝和肾中存在L及K两型PyK,肝中以L型为主,而肾中以K型较多,L:K的平均活性比值分别为6.07及0.248。但骨胳肌中只有M型。用聚丙烯酰胺凝胶板电泳也可获得相似的同工酶谱。用硫酸铵沉淀结合层析又从大鼠红细胞中提取了R型PyK,与上述三型一起,进行了催化性质的比较研究。结果如下: 1.K型对热极不稳定,而M型对热最为稳定。2.L型和K型可利用GDP代替ADP作为底物,但GDP作为底物时的酶活性远小于ADP作底物时的活性。M型利用GDP的能力很小,而R型几乎可忽略不计。3.某些氨基酸可抑制PyK,K型PyK对氨基酸的抑制最为敏感,可使其抑制的氨基酸最多,而M型最不敏感,在测定的12种氨基酸中仅受苯丙氨酸抑制,L型与R型介于上述两型之间,可使它们抑制的氨基酸种类相似。4.氨基酸对PyK的抑制作用与它们代谢途径中成糖或成酮的关系尚不明确,而与其结构有密切关系。能抑制PyK的氨基酸主要是非极性氨基酸,如丙、正丁、脯、苯丙氨酸等,当这四种氨基酸的侧链羟化成相应的丝氨酸、苏氨酸、羟脯氨酸或酪氨酸后,其抑制作用明显减弱或消失。5.小侧链的脂肪族氨基酸(如半胱、丙、正丁)对L型PyK的抑制作用强于大侧链的芳香族氨基酸(苯丙、酪);但对K型PyK的抑制却弱于大侧链芳香族氨基酸。并且L型对小侧链氨基酸的敏感性大于K型,而对大侧链氨基酸的敏感小于K型。6.丙氨酸对L、R、K三型PyK的抑制作用与其α-氨基和直链结构有密切关系,其中α-氨基尤为重要。7.果糖-1,6-二磷酸(FDP)能激活R及K型PyK,当底物PEP处于低浓度时,尚可激活L型。FDP还能逆转各种氨基酸对四型PyK同工酶的抑制作用,其中对R及K型的逆转效果较大。FDP对各种氨基酸抑制的逆转效应并不相同。8.丝氨酸可显著激活K型PyK,也可逆转氨基酸对K型PyK的抑制作用,其逆转效率仍因氨基酸而异,但其激活作用与FDP不能相加。对上述结果作了讨论,认为这些PyK同工酶催化性质的差异可有助于鉴定未知样品中的同工酶类型。还提出一个PyK同工酶上有两类氨基酸结合点的假说。     

尿激酶受体反义RNA抑制人乳腺癌细胞的侵袭作用

将尿激酶受体 u PAR反义 RNA表达质粒 p URAS以脂质体法转染高侵袭性人乳腺癌细胞株 MDA- MB- 2 31 ,G41 8筛选抗性克隆 .Northern印迹法检测 u PAR反义 RNA的表达 ,RT- PCR法检测 u PAR的表达 ,牛奶板法测定细胞培养上清中纤溶活性 .改良 Boyden小室模型和裸小鼠乳房脂肪垫接种试验分别检测肿瘤细胞体外和体内侵袭能力 .反义克隆细胞能表达 u PAR反义RNA,其 u PAR表达水平及培养上清中纤溶活性明显降低 .反义细胞克隆体外侵袭能力比原代细胞 MDA- MB- 2 31和转染载体细胞克隆显著降低 .裸小鼠体内侵袭实验表明 ,反义细胞克隆的成瘤性、生长性和侵袭性均显著受到抑制 .u PAR至少在一部分恶性乳腺癌侵袭行为中发挥重要作用 ,反义 RNA可望成为抗肿瘤侵袭治疗的一种有效手段 .     

降低细胞内tTG活性可使细胞获得对TNF-α的抗性

 用 Northern印迹证实在 He La细胞中有 t TG的表达 ,且这种表达受 TNF-α的上调 .构建t TG反义真核表达质粒并转染 He La细胞 ,用 G41 8抗性筛选稳定表达的转染细胞 ,并用 Northern印迹和 t TG活性测定进一步分析反义 t TG的转录 .用结晶紫及 MTT法证实阳性细胞克隆获得了对 TNF- α的抗性 ,而转染表达载体 pc DNA3的细胞仍对 TNF- α敏感 .结果表明降低 t TG活性能使细胞对 TNF- α诱发的细胞凋亡敏感性降低     

抗人PAI－1单克隆抗体制备、鉴定和应用

以重组PAI－（rPAI－1)为抗原,通过杂交瘤技术获得6株阳性杂交瘤细胞(Apl、AP2、AP3、AP4、AP5和AP6),并用SPA亲和层析纯化了抗Pal－1单克隆抗体(McAb)。所有McAb均能识别rPAI和天然PAI－1,腹水滴度均为10　6以上。6种McAb对PAI－1亲和常数在3．45×10⁷--1.05×10⁹mol／L之间。AP2、AP3McAb能完全抑制PAI－1活性,AP4、AP和AP6只能部分抑制PAI－1活性,Apl则不抑制PAI-1活性。6种McAb中只有Apl、AP4和AP5能识别Pal－1／t－PA复合物。利用Apl、AP3、和AP4 McAb制备免疫亲和柱一步纯化HepG2细胞分泌的PAI－1,纯度大于98％,回收率92％,纯化倍数51倍。利用抗PAI－1 McAb建立了夹心法ELISA,测定了人血浆PAI－1水平,正常人血浆PAI－1平均含量(X士D)为24．7±7．75ng／ml。     

基因工程链激酶(r—SK)纯化及其单克隆抗体制备和鉴定

采用Rotofor等电聚焦和分子筛技术纯化大肠杆菌表达的重组链激酶(r—SK),其纯度为97%。比活性1×10⁶IU／mg,回收率41％。分析所纯化的r—SK　N端氨基酸顺序证实其1—15个氨基酸顺序与SK基因的核苷酸顺序所示3联密码子一致。以纯化r—SK为抗原,通过杂交瘤技术构建了分泌抗r—SK单克隆抗体(McAb)杂交瘤细胞(4D11),该McAb属IgG1亚型．特异地作用于r-SK和C组口溶血性链球菌分泌的SK。用底物显色法测定该McAb可抑制SK对纤溶酶原的激活。Western blot法证实该McAb能识别分子量为16 250Da的r—SK的CNBr裂解片段。推测SK蛋白中第71残基至第237残基间的氨基酸顺序参与SK与纤溶酶原的结合。