副猪嗜血杆菌ompP2 基因的结构特征及其与毒力的联系

副猪嗜血杆菌ompP2 基因存在两种结构类型, 但其生物学意义人们还不清楚. 本实验
旨在进一步分析副猪嗜血杆菌ompP2 基因的结构特征并研究其与毒力的联系. 测序结果表明,
与参考菌株血清1, 3, 6, 7, 8, 9, 11 型相比, 19 株临床分离株及血清型2, 4, 5, 10, 12, 13, 14, 15 的
参考菌株的ompP2 基因存在两处连续碱基缺失, 分别位于450~524 和770~844 bp 范围内, 共
计100 bp 左右, 对81 株临床分离株的PCR 检测进一步证实此结果. 序列分析发现, 由于碱基
的连续缺失导致ompP2 基因表面暴露环减少一个, 但却使暴露于膜外的抗原决定簇个数增加,
并且临床分离株和所有毒力参考菌株中均有一个相同的、无毒菌株所没有的膜表面抗原决定簇
VTDQ(K)ALGVGL, 提示暴露于膜外的抗原决定簇可能与毒力相关. 构建两种基因结构类型
的真核表达载体转染Marc145 细胞, 结果显示碱基缺失的血清5 型ompP2 基因编码蛋白的细
胞毒性显著强于血清11 型, 首次证明ompP2 基因结构特征与毒力的关系.     

短发夹结构RNA干扰新城疫病毒的增殖

 以新城疫病毒（NDV）NP基因为标靶,构建3个细胞内表达发夹样结构小干扰RNA（shRNA）的质粒载体,在鸡胚成纤维细胞（CEF）和鸡胚上进行了RNAi试验,筛选出一个有效抑制病毒复制的小分子ndv1.用阳离子脂质体转染试剂Silent-fect 将ndv1转染CEF,以不相关shRNA质粒载体HK为阴性对照,4 h后接种NDV,与对照相比,干涉组在病毒感染后3 h NP基因的表达量降低2.3倍,6 h 降低21.1倍,9 h降低9.8倍;ndv1能在48 h内完全阻断NDV在CEF中的增殖,延缓病变出现时间,减轻病变程度.将Silent-fect-ndv1混合物与NDV同时注入10日龄SPF鸡胚绒毛尿囊腔,能使10⁵ ELD₅₀NDV感染后17 h鸡胚尿囊液中病毒增殖量减少94.4%,使10⁶ ELD₅₀NDV感染后17　h鸡胚尿囊液中病毒增殖量减少62.5%.实验结果证实,在CEF中存在RNAi机制,抑制NDV NP基因的表达能有效阻断该病毒增殖,说明NP基因在NDV复制过程中起重要作用.实验结果为进一步利用RNAi技术在CEF和鸡胚中研究病毒基因组功能及筛选抗病毒小分子奠定了基础.     

三重PCR检测鱼类致病性嗜水气单胞菌

[目的]建立一种能够快速准确地检测致病性嗜水气单胞菌的PCR.方法.[方法]根据嗜水气单胞菌的16S rRNA、气溶素基因(aer)和丝氨酸蛋白酶基因(ahp)的保守序列设计了3对引物,然后进行了PCR反应条件的优化、特异性和敏感性的检测并与普通的细菌分离鉴定进行了临床样本和人工攻毒样本检出率的比较.[结果]该方法特异性好,只对致病性嗜水气单胞菌呈阳性扩增;敏感性高,最低可检测100fg的细菌DNA模版.对临床疑似黄鳝(Monopterus albus)样本的检出率为81.8%,高于细菌分离的40.9%;对人工攻毒鲫鱼(Carassius auratus)样本的检出率为87.5%,高于细菌分离的67.5%.[结论]本方法的成功建立,实现在同一反应管中同时对16SrRNA、aer和ahp的检测,避免了只针对aer或ahp单个毒力基因的PCR检测方法可能存在的漏检和误检,为致病性嗜水气单胞菌的诊断、大规模检疫、流行病学调查等提供了一种快速、准确而有效的检测方法.     

冷诱导RNA结合蛋白在应激状态下对细胞的保护作用机制

冷诱导RNA结合蛋白(cold-inducible RNA-binding protein,CIRP)是目前哺乳动物中被广泛研究的冷应激蛋白之一。CIRP在脊椎动物间高度保守,在多种类型的细胞中均有表达,参与体内多种生物学过程。在应激条件下,CIRP从细胞核迁移到细胞质的应激颗粒中,通过与其特异靶基因结合,发挥一系列生物学效应,帮助细胞快速适应各种环境应激,尤其在温和低温、紫外线、缺氧等应激条件下,CIRP被诱导表达,通过与其特异靶基因结合、增加mRNA的稳定性、抗细胞凋亡等方式发挥细胞保护作用。文章重点对冷诱导RNA结合蛋白在应激状态下的细胞保护作用机制的研究进展进行综述。     

腺病毒载体介导的GFP基因在鸭胚成纤维细胞中的表达及RNA干扰

目的：建立在鸭胚成纤维细胞（DEF）中进行RNA干扰（RNAi）的技术平台,为鸭基因组功能的研究提供新的技术手段。方法：以绿色荧光蛋白（GFP）基因为报告基因,脂质体转染化学合成的GFP特异小干扰RNA（GFP-siRNA）,用流式细胞仪测定GFP-siRNA对重组腺病毒（Adv-GFP）介导的GFP基因在DEF中表达的干扰效果。结果：200MOI（感染复数）Adv-GFP介导的GFP基因在DEF中表达效率最高,为31．20％±3．1l％,对DEF的活力无明显影响;GFP-siRNA能有效干扰GFP基因在DEF中的表达,相对抑制率为98．56％。结论：在DEF中进行RNAi是可行的,Adv-GFP是介导外源基因在DEF中表达较为理想的载体;首次建立了在DEF中进行RNAi的技术平台,为鸭基因组的功能等研究提供了新的技术手段。