树脂包埋胃粘膜上皮细胞内β－葡萄糖醛酸酶免疫电镜的研究

树脂包埋胃粘膜上皮细胞内β－葡萄糖醛酸酶免疫电镜的研究张弘,康麟,于安民,陈铁镇,刘树立（中国医科大学病理解剖学教研室,沈阳１１０００１,沈阳市大东区卫生局）许多研究证实了细胞中含有的溶酶体酶与炎症反应,细胞毒性,抗原改变等有关,有的文献提示溶酶体酶...     

胰蛋白酶酶解文蛤的工艺条件

用正交试验法确定胰蛋白酶酶解文蛤的最佳工艺条件 ,用薄层层析和氨基酸自动测定仪鉴定酶解液中氨基酸的种类和含量 ,进一步判定酶解效果。结果表明 :在 5 0℃ ,加酶量 2 %,pH8.0 ,酶解 8h的酶解效果最好。层析发现 ,酶解温度为5 0℃的提取液含氨基酸较全面 ,氨基酸自动测定仪测定显示 ,胰蛋白酶酶解法的文蛤提取液中氨基酸的含量大于热水提取法的含量。     

胰蛋白酶的固定化及其性质研究

 以自制的脱乙酰壳多糖作载体,戊二醛为交联剂,对胰蛋白酶的固定化条件及其固定化酶的性质进行了研究。考查了交联剂的用量、pH值、以及载体与酶的比例等因素对胰蛋白酶固定化的影响。在所选择的固定化条件下,固定化酶的活性回收可达50％以上。同时研究了固定化胰蛋白酶的一些性质;最适温度60℃,最适PH8.0,Km值比可溶性酶升高,热稳定性、pH贮存稳定性以及在乙醇水溶液中的稳定性明显高于可溶性胰蛋白酶。在柱式反应器内,以2％酪蛋白为底物对,操作半衰期为40天。     

共价法固定化胰蛋白酶的研究

碳二亚胺、环氧等方法研究了胰蛋白酶的共价固定化,测定了这些方法的固定化酶蛋白回收、固定化酶活力回收和固定化酶的相对比活力。实验结果表明前三种方法效果较好,蛋白回收分别为59%、93％和28％,活力回收为53％、38％和20％,考察了这三种固定化胰蛋白酶的最适温度、最适pH、表观米氏常数和工作稳定性。此外,本文对上述三种不同的固定化方法引起酶对大分子底物(偶氮酪蛋白)和小分子底物(BAPNA)的活力的影响也作了初步的探讨。     

固定化胰蛋白酶活力的测定方法探讨

对自制的固定化胰蛋白酶(Immobilization Trypsin,ITP)分别经过冷冻干燥、真空干燥后定量测定其酶活力,与由湿态直接定量法(DQA)测定的活力进行比较。试验表明,直接定量方法测定的酶活力比前两者高,而且操作简单。     

胰蛋白酶的天然抑制剂

一、引言在自然界存在着一类能抑制胰蛋白酶的蛋白质。它们中固有些专一地抑制胰蛋白酶;有些除胰蛋白酶外,还能抑制其他生物活性物质,如胰凝乳蛋白酶、溶血纤维蛋白酶(plasmin)等;近年还发现一些所谓多头抑制剂(multiheaded inhibitor),它们能同时,并按一定比例地抑制胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶。胰蛋白酶抑制剂广泛地分布在动、植物中。这类蛋白质的生理作用,还不很清楚。在胰脏和胰液中的胰蛋白酶抑制剂据推想,此抑制剂可能使那些由胰蛋白酶原转变而来的胰蛋白酶在胰脏或其导管系统中失去活性,从而对于胰脏本身具有保护作用。显然,对它们的研究,将有助于对动、植物机体内某些     

麦芽糖的改性及其化学修饰胰蛋白酶的研究

目的:通过高碘酸钠氧化法以麦芽糖修饰胰蛋白酶,检验此方法是否能够改善胰蛋白酶的稳定性.方法:采用高碘酸钠改性麦芽糖,使其中具有能够与酶分子中氨基结合的醛基,从而在一定条件下化学修饰胰蛋白酶.结果:改性麦芽糖的最佳条件为,高碘酸钠浓度0.05g/mL,高碘酸钠与麦芽糖质量比1.1∶1,初始pH 1.0,反应时间3h,反应温度30℃;修饰胰蛋白酶的最佳条件为,pH6.0,改性麦芽糖与胰蛋白酶质量比1∶1,修饰温度4℃,修饰时间24h;在最佳条件下修饰酶后,pH在8.9～10.0时,原酶活力与修饰酶活力分别下降了其最高活力的15.8%和9.8%;将酶置于50℃ 2h后,原酶与修饰酶分别保留了其置于4℃ 2h后活力的88.7%和94.7%.结论:该方法能够提高胰蛋白酶的耐碱稳定性和热稳定性.     

增强化学发光免疫分析技术

将抗体或抗原以共价键或其它形式与酶偶合,形成酶标记抗体或酶标记抗原。酶标记抗原或抗体保留免疫学活性和酶学活性,因而既有抗原抗体反应的特异性,又有酶促反应的生物学放大作用。     

人体肝癌细胞膜相关胚胎抗原的研究

近十多年来实验和临床肿瘤免疫研究的结果说明,正常细胞转变为癌细胞以后,癌细胞表面出现了许多新的抗原。在不同类型的肿瘤中,这些抗原可以是病毒抗原、胚胎抗原、组织专一抗原或其他的肿瘤相关抗原。所谓胚胎抗原一般指的是胚胎组织和肿瘤组织所共有的、而成年机体相应的正常组织所很少有的抗原,它们有的是可溶性的,由癌细胞合成和分泌到体液,有的也可以存在于癌细胞的表面,可能是属于膜的组成部分的结构抗原。这些胚胎抗原的发现和研究具有一定的重要意义,在理论上为肿瘤的产生与胚胎发育和分化的关系提供了新的线索,如基因重新激活学说的提出等等;在实践上已为肿瘤的     

不同载体固定化胰蛋白酶的条件研究

试验分别选用壳聚糖、复合硅胶、阴离子交换树脂为载体制备固定化胰蛋白酶,通过正交试验优化确定不同载体的酶固定条件。研究表明,三种载体固定胰蛋白酶时的酶活回收率依次为81.9%、80.1%、44.8%。     

测序级胰蛋白酶的制备工艺与质量检测

目的:制备高纯度、酶解效率高、酶切位点专一的测序级胰蛋白酶,应用于蛋白组学研究的蛋白质鉴定与分析中。方法:取实验室自制的猪胰蛋白酶粗酶,经硼氢化钠、甲醛还原甲基化修饰抑制胰蛋白酶自水解,采用高效液相色谱仪15RPC反相柱纯化,收集对应的甲基化胰蛋白酶峰组分,冷冻干燥;甲基化修饰的胰蛋白酶进一步经甲苯磺酰苯丙氨酰氯甲酮(TPCK)修饰,以抑制糜蛋白酶等非特异性酶切活性,并经反相色谱柱再纯化,获得终产物即质谱测序级胰蛋白酶;自制的测序级胰蛋白酶经SDS-PAGE、HPLC反相色谱分析、酶比活力测定,并应用于胶内蛋白质酶切质谱鉴定氨基酸序列等,检测其纯度、酶水解效率及酶切位点特异性。结果:自制甲基化TPCK修饰的测序级胰蛋白酶纯度大于95%,酶比活力为200 U/mgP(TAME)以上,质谱分析酶切特异性好;且酶的制备工艺流程稳定,可应用于测序级胰蛋白酶产品的生产与开发中。结论:制备的测序级胰蛋白酶纯度高、酶解效率优、酶切特异性强,可广泛应用于实验室中蛋白质和肽段测序鉴定、HPLC肽段谱图分析等蛋白组学研究分析中。     

使用胰蛋白酶进行胶内酶解

在蛋白质组学实验中,双向电泳分离得到的蛋白质点通常需要进行胶内酶解后再使用质谱鉴定,而胶内酶解是否成功直接决定了质谱鉴定的结果。本文以最常用的胰蛋白酶为例讲述胶内酶解的具体操作。     

纤维素载体的酶免疫测定技术

纤维素载体的酶免疫测定技术黎皓（北京生化免疫制剂中心开发室）程伯鲲（中国预防医科院流研所微生物室）自１９６６年Ｎａｋａｎｅ建立酶标记抗体技术以来,酶免疫测定技术（ＥｎｚｙｍｅＩｍｍｕｎｏａｓ－ｓａｙｓ,ＥＩＡ）在很多领域得到广泛应用,被认为是继放射免疫测定技术（ＲＩＡ）和荧光免疫测定技术（ＩＦＡ）之后的一项重要的免疫测定技术。其原理是通过化学方法将酶与抗体（或抗原）结合起来,酶标记后的抗体（或抗原）仍然保持与相应抗原（或抗体）相结合的免疫学活性以及酶的催化活性, 酶标记抗体与抗原结合后, 形成酶标抗体一抗原复合物。     

体外人表皮细胞对胰蛋白酶耐受的探讨

目的:观察人表皮细胞对胰酶消化的耐受能力,通过不同细胞恢复贴壁时间不同来探索分离和纯化表皮细胞的新方法,并探讨胰酶耐受细胞的干性表达,及其与muse细胞的可能相关性。方法:中性蛋白酶及胰酶消化获取表皮细胞,用0.25%的胰酶悬浮表皮细胞,以3.0×105/m L的细胞密度种植于12孔板,每间隔半小时或1小时终止胰酶1孔,其中胰酶作用时间最长达46小时。记录不同细胞贴壁时间、生长状态,并在接种后第7天,对贴壁细胞进行Nestin、Sox10抗体免疫细胞化学染色。结果:随着胰酶作用时间的延长,贴壁细胞数目递减,细胞贴壁所用时间也延长。所有孔中最早出现的贴壁细胞为树突状细胞,这些细胞开始生长缓慢,大约4天后生长迅速,10天后部分孔出现鱼群样细胞团。部分孔经Nestin、SOX10抗体的免疫细胞化学染色结果均为阳性,其中以Nestin抗体较明显。结论:人表皮细胞对胰酶消化的耐受能达46小时,从形态学观察判断,黑素细胞贴壁早于角质形成细胞,大多数贴壁后细胞增殖力强,干细胞表面标记显示部分阳性。     

刺桐胰蛋白酶抑制剂基因的构建及表达研究

刺桐胰蛋白酶抑制剂是胰蛋白酶、组织型纤溶酶原激活剂及瑞替普酶特异性的抑制剂,可作为配基制成亲合填料用于纯化上述酶。通过化学合成和PCR结合法合成了ETI基因,经过序列分析后将其克隆到大肠杆菌表达载体质粒pET32a中,并在大肠杆菌中进行诱导表达。表达蛋白分子量同理论值一致,生物活性检测表明复性后的ETI对胰蛋白酶及瑞替普酶具有特异抑制作用。     

甲醇对胰蛋白酶催化活性影响的机理研究

为了探索甲醇影响胰蛋白酶催化活性的作用机理,将胰蛋白酶纯化到电泳纯的水平,用纯酶进行了催化动力学研究;测定了酶分子的紫外吸收光谱、紫外差示光谱和荧光发射光谱的变化.试验结果表明:胰蛋白酶经7%甲醇处理时,其比活力比对照提高了17.97%.经甲醇处理后的胰蛋白酶,其动力学参数Km值及Vmax值均得到提高,且Vmax提高幅度比较大.甲醇处理后,酶的紫外吸收光谱基本没有变化,其差示光谱出现明显的正峰和负峰,而其荧光发射光谱也基本不变,只是荧光强度有所增加.实验结果证明,在7%甲醇存在下,胰蛋白酶分子构型不变,酶活性的变化是甲醇引起酶分子构象改变的结果.     

超声对胃蛋白酶，胰蛋白酶，过氧化氢酶作用的研究

以胃蛋白酶,胰蛋白酶,过氧化氢酶溶液在超声处理下的酶活变化为指标研究超声对蛋白质作用的机理和影响因素。结果表明超声对蛋白质的破坏程度随着功率的升高或处理时间的延长而增加;三种酶在超声作用下酶活变化形式和程度各不同;浓度是影响超声对酶作用效果的一个重要因素,可通过调整酶溶液浓度来减少酶所受到的破坏程度。自由基清除剂甘露醇和非离子表面活性剂吐温-80可以对酶活在超声作用下起到一定的保护作用,说明自由基和超声空穴是超声破坏酶结构的重要机理,研究结果同时表明对于不同的酶,超声的破坏作用可能有不同的发挥主导作用机理。     

α-半乳糖苷酶清除猪细胞表面的α-Gal抗原

目的:探讨脆弱类杆菌来源的基因重组α-半乳糖苷酶清除猪细胞表面α-Gal抗原的作用。方法:用不同浓度的α-半乳糖苷酶酶解猪红细胞、猪胚肾细胞PK15、猪睾丸细胞ST和原代培养的猪成纤维细胞上的α-Gal抗原,酶解温度为26℃,作用时间为2 h;用25μg/m L的FITC-IB4凝集素标记酶解前后的细胞,采用流式细胞仪检测细胞表面α-Gal抗原的清除率。结果:流式细胞检测结果表明,不同组织来源的猪细胞表面的α-Gal抗原的表达量明显不同,所需酶的剂量也不同,但其表面的α-Gal抗原均能被α-半乳糖苷酶清除。结论:脆弱类杆菌来源的α-半乳糖苷酶可以清除猪细胞表面的α-Gal抗原,提示该酶对降低异种移植引起的超急性排斥反应有重要意义。     

固相酶制备与应用的一些研究

在天然情况下,有的酶分泌在细胞外;有的则存在于细胞内。细胞内的酶,有的以溶于水的形式存在于细胞浆内;也有一些酶存在于细胞的细微结构上,在正常情况下不溶于水。不溶于水的酶经过一定处理,也能成为水可溶的酶;水可溶酶经过处理也可变为水不可溶的酶。经过这种处理的酶称为固相酶。近年来,固相酶的研究有了迅速的发展。     

一种酶免疫传感器的制备和性能测试

这种酶免疫传感器是采用丝素蛋白溶液将待测抗原(兔IgG)固定在基础电极表面,选用抗体(山羊抗兔IgG-HRP)与其识别结合。利用H2O2将抗原抗体结合的电位响应信号放大而检测抗原的浓度。该传感器测定抗原的最低检测浓度1.0×10-10 mol/L,线性范围1.0×10-8~1.0×10-10 mol/L,响应时间为10s。通过电泳的方法加速抗原抗体的识别结合,反应时间由原来的90min缩短到30min,这在国内外鲜有报道。这种以固定化抗原结合酶标抗体量的多少作为检测抗原标准的新型酶免疫传感器,在临床检测、生物医学研究等领域将会有广阔的应用前景。