綠豆中两種小分子胰蛋白酶抑制剂的提取与结晶

胰蛋白酶抑制剂的分布很广,存在于各种莢果植物种子中,如大豆、龙爪豆、豌豆及藊豆等,蔬菜中的馬鈴薯、甘薯以及动物中的胰脏、初生乳汁、血清、鸡蛋白、胎盘和尿等。上述来源的抑制剂不少已提純或获得結晶。它和胰蛋白酶結合后彼此都丧失活性,犹似抗原对抗体的結合,是属于一种蛋白貭相互作用的     

绿豆胰蛋白酶抑制剂的研究——Ⅸ.两活力碎片及抑制剂的一级结构

前文已报道绿豆胰蛋白酶抑制剂经胃蛋白酶酶解后能使两个活性区域拆开,分离后的两活力碎片,经证实它们的活性中心分别为Lys 及Arg,并测定了各自的氨基酸组成及N、C 末端。今在此基础上确定了绿豆抑制剂的全部氨基酸排列顺序。     

绿豆胰蛋白酶抑制剂的研究 Ⅸ.两活力碎片及抑制剂的一级结构

前文已报道绿豆胰蛋白酶抑制剂经胃蛋白酶酶解后能使两个活性区域拆开,分离后的两活力碎片,经证实它们的活性中心分别为Lys及Arg,并测定了各自的氨基酸组成及N、C末端。今在此基础上确定了绿豆抑制剂的全部氨基酸排列顺序。一、绿豆抑制剂N端的氨基酸顺序天然绿豆胰蛋白酶抑制剂在聚丙烯酰胺凝胶电泳中显示有四条不同粗细的条纹,样品的N末端分析主要有Ser及Asp,它们是属于差异极少的异构体,具有完全相同的活     

绿豆胰蛋白酶抑制剂的研究——Ⅷ.两个活性碎片的拆分

1.绿豆胰蛋白酶抑制剂有二个活性中心,可以同时抑制两分子胰蛋白酶。用苯乙二醛及顺丁烯二酸酐分别进行化学修饰,都可使其活力降低至原有的50%左右,表明此两活性中心分别应为精氨酸残基及赖氨酸残基。2.绿豆抑制剂经胃蛋白酶酶解后,活力不丧失,在凝胶过滤中出现分子量为原抑制剂一半的新活力峰,经证实为两个不同活性中心的活力碎片。3.利用两活性中心残基赖氨酸和精氨酸侧链基团解离pK值的差异,在pH11.4的条件下通过固相胰蛋白酶亲和层析可将两活力碎片彼此分离。分离所得两碎片活力大致相等。4.以赖氨酸为活性中心的碎片能被顺丁烯二酸酐全部抑制失活,在pH3.5下保温却和原抑制剂一样能恢复其原有活力的90%以上。此活力碎片由两条肽链所组成,共含35个氨基酸残基,N-末端为丝氨酸和苯丙氨酸,两C-末端分别为亮氨酸及甲硫氨酸。5.以精氨酸为活性中心的碎片的活力能被苯乙二醛全部抑制,经鉴定为一条肽链,其含约27个氨基酸残基,N-末端为门冬酰胺,C-末端为门冬氨酸。     

绿豆胰蛋白酶抑制剂的研究——Ⅷ.两个活性碎片的拆分

1.绿豆胰蛋白酶抑制剂有二个活性中心,可以同时抑制两分子胰蛋白酶。用苯乙二醛及顺丁烯二酸酐分别进行化学修饰,都可使其活力降低至原有的50%左右,表明此两活性中心分别应为精氨酸残基及赖氨酸残基。2.绿豆抑制剂经胃蛋白酶酶解后,活力不丧失,在凝胶过滤中出现分子量为原抑制剂一半的新活力峰,经证实为两个不同活性中心的活力碎片。3.利用两活性中心残基赖氨酸和精氨酸侧链基团解离pK 值的差异,在pH11.4的条件下通过固相胰蛋白酶亲和层析可将两活力碎片彼此分离。分离所得两碎片活力大致相等。4.以赖氨酸为活性中心的碎片能被顺丁烯二酸酐全部抑制失活,在pH3.5下保温却和原抑制剂一样能恢复其原有活力的90%以上。此活力碎片由两条肽链所组成,共含35个氨基酸残基,N-末端为丝氨酸和苯丙氨酸,两C-末端分别为亮氨酸及甲硫氨酸。5.以精氨酸为活性中心的碎片的活力能被苯乙二醛全部抑制,经鉴定为一条肽链,其含约27个氨基酸残基,N-末端为门冬酰胺,C-末端为门冬氨酸。     

绿豆胰蛋白酶抑制剂的研究 Ⅱ.抑制剂A、B组份的关系及其化学结构的特征

前文曾报导自绿豆中抽提出两种结晶胰蛋白酶抑制剂A和B。但在制备过程中有时观察到A、B组份的比例有所改变,若A增多则B减少,反之亦然;若在热TCA中处理过份激烈,A有时又可一分为二。这是由于组織中确有两种或更多的组份存在,还是由于在制备过程中条件比较激烈,人为地由同一组份派生而来?为求确定此问题,我们在抽提过程中逐步观察了组份A和B间的关系,发现A确是由B派生而来。A和B的氨基酸组成和N末端完全相同,仅在酰胺含量上有所差别。我们还分析比较了抑制剂化学结构上的若干特点。     

苦荞胰蛋白酶抑制剂的纯化及特性研究

利用固相胰蛋白酶亲和色谱及离子交换色谱,从苦荞种子中分离纯化了三个具有抑制胰蛋白酶活力的组份(BTI-Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ)。经聚丙稀酰胺凝胶等电聚焦测定,三种抑制剂的等电点为6.87,6.7,5.14。根据Sephadex G-75凝胶过滤,SDS-PAGE测定,以及由当量抑制比值和氨基酸组份的推算,它们的分子量范围分别为5200-5700(Ⅰ),5500—6000(Ⅱ),5000—5600(III)。三者对胰蛋白酶的抑制常数分别为2.12×10~(-8),4.78×10~(-9),1.22×10~(-8)。氨基酸分析结果表明,它们均含有很高的极性氨基酸。在酸性条件下,它们均具有很高的热稳定性。化学修饰的结果表明,它们活性中心的氨基酸残基为Lys。     

绿豆胰蛋白酶抑制剂的研究——Ⅶ.N-端活力碎片的研究

绿豆胰蛋白酶抑制剂经溴化氰及胃蛋白酶限止性裂解后经固相胰蛋白酶亲和层析及Sephadex G-50柱分离可得一活力碎片,能当量抑制胰蛋白酶,它是属于抑制剂中两个活性区域中近N 端的一个,而近C 端的活性区域经CNBr 裂解后活力丧失。此活力碎片是由两条肽链所组成,通过两对二硫键相连结,它们分别含26及9个氨基酸残基,N 末端分别为丝氨酸及苯丙氨酸,C 末端分别为亮氨酸及高丝氨酸。活力碎片与牛胰蛋白酶当量结合后的络合物能获得片状或小颗粒晶体,在低pH 下解离后的活力碎片可用Sephadex G-50柱分离提纯,其氨基酸组成与抑制活力特性都保持不变。在pH 3～12范围内不同温度下测定活力碎片的稳定性,当pH 低于6时即使在100℃下加热10分钟也不失活,在较高pH 下活力碎片的失活情况大致上与天然抑制剂相仿。活力碎片再同时经过量氨肽酶与羧肽酶进一步酶解后,氨基酸残基数虽降至27个左右,活力仍不丧失,是目前已知分子量最小而活力又全保留的抑制剂活力碎片。     

绿豆胰蛋白酶抑制剂的研究 Ⅶ.N-端活力碎片的研究

绿豆胰蛋白酶抑制剂经溴化氰及胃蛋白酶限止性裂解后经固相胰蛋白酶亲和层析及Sephadex G-50柱分离可得一活力碎片,能当量抑制胰蛋白酶,它是属于抑制剂中两个活性区域中近N端的一个,而近C端的活性区域经CNBr裂解后活力丧失。此活力碎片是由两条肽链所组成,通过两对二硫键相连结,它们分别含26及9个氨基酸残基,N末端分别为丝氨酸及苯丙氨酸,C末端分别为亮氨酸及高丝氨酸。活力碎片与牛胰蛋白酶当量结合后的络合物能获得片状或小颗粒晶体,在低pH下解离后的活力碎片可用Sephadex G-50柱分离提纯,其氨基酸组成与抑制活力特性都保持不变。在pH 3～12范围内不同温度下测定活力碎片的稳定性,当pH低于6时即使在100℃下加热10分钟也不失活,在较高pH下活力碎片的失活情况大致上与天然抑制剂相仿。活力碎片再同时经过量氨肽酶与羧肽酶进一步酶解后,氨基酸残基数虽降至27个左右,活力仍不丧失,是目前已知分子量最小而活力又全保留的抑制剂活力碎片。     

波叶青牛胆胰蛋白酶抑制剂的纯化及其性质研究

采用亲和层析及电泳制备等方法 ,从防已科植物波叶青牛胆 (Tinosporacrispa)根茎中分离到一种胰蛋白酶抑制剂TCTI。对其性质研究表明 :TCTI的相对分子量约为 10 0kD ,对牛胰蛋白酶的抑制常数Ki为 2 0 8× 10 7mol/L (BAPNA为底物时 ) ,摩尔抑制比为 1∶3 5 ,是一种抑制活力很强的竞争性抑制剂。TCTI具有很高的耐热性 ,在 10 0℃加热 60min ,仍保持 93%的抑制活力。另外 ,TCTI在低温容易结晶     

硝酸还原酶的研究——Ⅵ.水稻硝酸还原酶的纯化和特性

水稻叶片NR在Blue Dextran-Sepharose 4 B亲和层析法的纯化过程中,继100μMNADH洗脱出现一个酶活峰后,再用0.25MKNO_3洗脱又出现一个更高的酶活峰。酶与BlueDextran-Sepharose 4B有两个结合位点,它们可能就是酶与底物NADH和NO_3的结合位点。NADH能和Blue Dextran竞争与酶结合而把NR从亲和柱上洗脱下来。硝酸盐除了具一般盐类的离子强度外,还有明显的底物效应。如果将KNO_3-洗脱的NR再反复进行亲和层析,又可得到NADH-洗脱和KNO_3-洗脱的两部分NR。这两部分NR在聚丙烯酰胺凝胶电泳和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳上都呈现一条相同的蛋白带。 水稻NR的全酶分子量约330Kd,亚基分子量约57Kd,故全酶可能由6个相同亚基组成,酶活的pH范围为6.5～8.5,最适pH为7.5;酶对底物NO_3-和NADH的K_m值分别为3.3×10~(-4)M和2.9×10~(-5)M。     

一种苦荞麦种子蛋白酶抑制剂的纯化、特性及其抗虫活性

蛋白酶抑制剂广泛存在于生物体内, 是自然界含量最为丰富且具有一定防御作用的蛋白种类之一. 本文采用离子交换层析和凝胶层析等方法,从苦荞麦种子中分离出一种胰蛋白酶抑制剂（TBTI-Ⅱ）. SDS-PAGE分析表明,TBTI Ⅱ的分子量约9.0 kD,由80个氨基酸残基组成,分子中含有较多的 Glu, Asp 和Arg. TBTI-Ⅱ具有较高热稳定性.当在100℃加热处理10 min后,仍保留有67.6%的抑制剂活性. 动力学测定显示,来自苦荞麦中的TBTI-Ⅱ对胰蛋白酶的抑制作用常数(Ki)为1.01×10－4 mol/L. 另外,将含有不同活力单位的苦荞麦蛋白酶抑制剂掺入到棉铃虫的饲料中进行饲养试验显示,TBTI-Ⅱ具有明显的抑制棉铃虫生长的作用. 这些结果表明,来自苦荞麦种子中的小分子蛋白酶抑制剂可能是一种潜在的抗虫因子.     

红藻生殖器官的研究 Ⅵ.几种粉枝藻及其生殖系统的发育

本文对采集于我国西沙群岛的羽枝粉枝藻(Liagora pinnata Harvey),鼓苞粉枝藻(L.setchellii Yamada),和采集于台湾省的密孢粉枝藻(L.boergesenii Yamada),互对粉枝藻(L.decussata Montagne)的果胞受精后生殖系统的发育作了描述;并认为包围丝的着生位置和数量可作为分种的依据。精子囊虽都是由营养细胞分裂出几个小细胞,由此再反复分裂,最后由顶端细胞形成,但由于各种粉枝藻的精子囊母细胞分裂的次数和数量各不相同,因而也可作分种的依据。我们认为 Yamada,Desikachary 和 Balakrishnan 所提出的分组是不合适的。     

依赖于DNA的RNA聚合酶的研究——Ⅵ.白血病615和正常615小鼠肝细胞的RNA聚合酶B免疫学特性比较研究

本文比较了白血病615(L615)和正常615小鼠肝细胞RNA聚合酶B的免疫学特性。在免疫扩散实验中,抗615B酶抗血清和抗L615B酶抗血清分别对615 B酶和L615 B酶的离体转录活性有明显抑制作用,但两种抗血清分别对与其对应的酶抑制作用强。用抗615 B酶抗血清的IgG分别与两种B酶进行免疫沉淀反应,它们的沉淀物凝胶电泳图谱显示能发生特异性结合反应。IgG与615 B酶的沉淀物电泳图中存在着一条明显的条带,而这一条带在IgG与L615B酶的沉淀物电泳图中却消失了。     

植物苯丙氨酸解氨酶的研究——Ⅵ.水稻、小麦PAL的纯化及基本特性

分离和纯化了的水稻和小麦黄化苗中的PAL,经聚丙烯酰胺凝胶电泳及SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检验均为单一的蛋白带。水稻、小麦的PAL都具有一定的耐热性,但前者略高于后者;两者的最适pH都在碱侧,前者为9.2,后者为8.8;并均能被巯基试剂NEM所抑制。此外,水稻的PAL比活远较小麦的高;水稻只有一个K_m值,为5.94×10~(14)M,而小麦则有二个,即K_m~L=0.625×10~(-4)和K_m~H=3.1×10~(-4)M。分析不同来源PAL的氨基酸百分组成,发现水稻的酸性氨基酸成分少于小麦;而中性及碱性氨基酸成分则高于小麦。用SDS电泳测得小麦亚基分子量为70,000而水稻则为57,500,推测小麦、水稻PAL全酶分子量分别为280,000与230,000道尔顿。     

东北地区野豌豆属VICIA L.物种生物学研究——Ⅵ.柳叶野豌豆复合种及其近缘种核型分析和细胞地理学研究

本文报道了国产北野豌豆Vicia ramuliflra(Maxim.)Ohwi和日本产V.fauviei Franch.和V.nipponica Matsum.的核型。北野豌豆古莲居群2n=12=2m(2SAT)+8sm+2st, 千山居群2n=12=6m+6sm。V.fauriei 2n=12=2m+8sm+2st, V.nipponica 2n=12=6m(4SAT)+4sm+2st, 核型分析表明核型主要由'm'、'sm'和'st'三种染色体组成, 核型对称性高(2A或3A)。染色体倍性分布格局, 形态特征和现代分布式样揭示黄山-西天目山-庐山-带山地可能是柳叶野豌豆复合种及其近缘种的起源中心和多样化中心, 四倍体的发生可能与第四纪山地冰川有关。     

丝瓜籽中一种具有翻译抑制活性和胰蛋白酶抑制剂活性的多肽——Luffin P1的纯化和性质

通过硫酸铵分级沉淀、CM 5 2阳离子交换层析、蓝胶亲和层析和FPLCMonoS阳离子交换层析 ,从丝瓜籽抽提液中分离到一种多肽luffinP1。经MALDI TOFMS测得其分子量为 5 2 2 6 .5。氨基酸序列测定及同源性分析发现 ,luffinP1的N端 11个氨基酸序列与丝瓜籽中的一种 6 .5K富含Arg Glu的多肽AGRP的部分序列相同 ,并与南瓜籽中一种胰蛋白酶抑制剂C2肽具有很高的同源性。体外分析表明 ,luffinP1同时具有两种生物活性 :(1)对兔网织红细胞裂解液系统蛋白质生物合成有较强的抑制作用 ,IC50 为 0 .6nmol L ;(2 )具有明显的胰蛋白酶抑制活性 ,IC50 为 2 2 μmol L。     

酚氧化酶及其酶原的研究进展(Ⅱ)——免疫学特性、细胞定位及其功能

酚氧化酶（Phenoloxidase,PO）又称为酪氨酸酶（tyrosinase,EC1．14．18．1）,是一种含铜的酶,能够催化单酚羟化成二酚（如多巴）,并把二酚氧化成醌;醌在非酶促条件下形成最终的反应产物黑色素。PO在脊椎动物和无脊椎动物中都广泛存在,而且被认为是一种参与免疫的重要因子。本文就酚氧化酶及其酶原的免疫学特性、细胞定位及其功能研究进展进行综述。     

两种猕猴桃花的生物学研究——Ⅱ.早期胚胎学

美味猕猴桃(Actinidia deliciosa)和中华猕猴桃软毛变种(A.chinensis var.chin-ensis)的胚珠系中轴胎座,倒生胚珠,单珠被和薄珠心。这两个猕猴桃种的大孢子发生相似,但是在四分体阶段,中华猕猴桃软毛变种只有合点端大孢子发育,而美味猕猴桃四个大孢子中的任何一个大孢子都可具功能。大孢子发生属蓼型。合子休眠约8周。