体外诱导人骨髓间充质干细胞向多巴胺神经元分化的研究

通过体外诱导人骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stemcells,BMSCs)向多巴胺(dopamine,DA)神经元分化,探讨人BMSCs来源的DA神经元的功能特征及其分化机制,为临床上细胞移植替代治疗诸如帕金森氏病(parkinson’sdisease,PD)等神经精神性疾病提供一种理想的细胞来源。通过密度梯度离心获取人骨髓中的单个核细胞,贴壁培养纯化BMSCs。50μmol/L脑源性神经营养因子(brain derivedneurotrophy factor,BDNF),10μmol/Lforskolin(FSK)和10μmol/LDA联合对BMSCs进行诱导。电子显微镜观察诱导2周后细胞是否具有神经元的超微结构特点;免疫细胞化学染色和RT-PCR检测DA神经元分化过程中的标志物酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase,TH)的表达以及转录因子Nurr1、Ptx3和Lmx1b的表达;高效液相色谱(highperformance liquid chromatogram,HPLC)检测诱导2周后的细胞多巴胺的释放水平。结果表明,诱导2周后,电镜下细胞胞浆中有大量密集的呈扁平囊状的粗面内质网及其间的一些游离核糖体以及神经微丝的形成。RT-PCR结果显示NSE(neuron specificenolase)、Nurr1、Ptx3、Lmx1b和TH的mRNA均有表达;免疫细胞化学染色结果表明诱导2周后TH阳性细胞(24·80±3·36)%的表达较诱导3d后(3·77±1·77)%明显提高(P<0·01);HPLC检测到诱导2周后的细胞DA释放水平[(1·22±0·36)μg/mL(n=6)]高于未经诱导的细胞[(0·75±0·22)μg/mL(n=6)(t=-2·79,P=0·038)]。由此得出,BDNF、FSK和DA可以在体外诱导人BMSCs向DA神经元分化,并具有DA神经元的功能特征,是临床用于治疗神经精神性疾病的理想细胞来源。     

诱导人脐血间充质干细胞分化为多巴胺能神经元样细胞的研究

目的：探讨人羊膜上皮细胞条件培养液(ACM)及SHH,FGF8诱导人脐血间充质干细胞（CB-MSCs）分化为多巴胺( dopamine,DA )能神经元样细胞的作用及机制。方法：利用沉降红细胞、密度梯度离心和贴壁筛选法纯化CB-MSCs,加入ACM及SHH,FGF8分为CON,ACM,SHH+FGF8,ACM+SHH+FGF8四组诱导48h后,免疫细胞化学染色鉴定分化细胞的DA神经元表型。应用高压液相色谱技术测定细胞培养上清中DA含量,并应用Realtime PCR方法观察DA能神经元发育过程中的相关基因En-1,Foxa2,Lmx1b,Gli-1,Pitx3,Nurr1以及Ngn2的表达。结果：加诱导剂诱导48h后,各诱导组的TH和DAT的表达量均比对照组高。早期的转录因子En1,Foxa2 在各组中均有表达;而Pitx3,Lmx1b表达在各诱导组中;Lmx1b在ACM+SHH+FGF8组中表达最高;Pitx3在各诱导组中均有表达且无明显差异。Nurr1,Ngn2在SHH+FGF8组中表达很强。结论：ACM及SHH,FGF8可诱导脐血间充质干细胞分化为DA能神经元样细胞,其作用机制与多巴胺能神经元发育过程中的各种基因En-1,Foxa2,Lmx1b,Gli-1,Pitx3,Nurr1以及Ngn2相关。     

Wnt 3a在神经干细胞向多巴胺能神经元分化过程中作用的研究

Wnt信号在中枢神经系统发育过程中起重要的作用,控制着细胞的生长及分化.Wnt3a是Wnt家族的成员之一,对神经干细胞的增殖及分化有一定的调控作用.将重组Wnt3a腺病毒转入神经干细胞中,研究Wnt3a在定向诱导神经干细胞向多巴胺能神经元分化过程中的作用.将神经干细胞分为4组,对照组(不加任何诱导因子组)、抗坏血酸诱导组(AA组)、Wnt3a重组腺病毒诱导组(Wnt3a组)以及Wnt3a重组腺病毒加抗坏血酸诱导组(Wnt3a AA组).结果显示,Wnt3a组细胞中的多巴胺能神经元前体细胞特异性标志Nurr1表达量显著增多,Wnt3a AA组多巴胺能神经元明显多于AA组,酪氨酸羟化酶(TH)在mRNA水平上的表达是AA组的1.86倍.蛋白质印迹及免疫细胞化学染色显示,各诱导组均有TH的表达,Wnt3a组和AA组多巴胺能神经元阳性细胞数比例分别为(5.76±3.34)%和(37.42±2.54)%,与Wnt3a AA组(73.96±2.61)%比较,差异有统计学意义(P<0.05).利用高效液相色谱法检测到诱导后的细胞可分泌多巴胺.结果表明,Wnt3a可促进神经干细胞向多巴胺能神经元前体细胞分化,再通过抗坏血酸的诱导作用,在体外可获得大量的多巴胺能神经元,这些神经元有分泌多巴胺的功能.     

骨髓基质干细胞的诱导分化及其治疗癫痫的实验研究

目的探讨骨髓基质干细胞诱导分化为神经元样细胞的方法及脑内移植治疗大鼠癫痫模型的作用。方法无菌条件下分离纯化BMSCs,用bFGF 10ng/ml、RA0.5μmol/L的DMEM/F12诱导72h后,部分用于免疫荧光检测nestin,其余的继续用bFGF 10ng/ml、RA 0.5μmol/L及神经营养因子NT-3 20ng/ml、BDNF 20ng/ml的DMEM/F12诱导4d,检测GAD67。皮下注射匹罗卡品建立癫痫大鼠模型,采用行为学分析筛选模型。通过立体定位仪,用微量注射器将BMSCs来源的神经干细胞和神经营养因子移植入癫痫鼠海马内,观察大鼠行为变化,存活2、4周后,心脏灌注取脑,冰冻切片免疫组化双标检测移植细胞的存活、迁移、分化情况。结果BMSCs诱导72h后,nestin表达阳性,4d后GAD67检测60%阳性。采用匹罗卡品造模,方法简便,但死亡率较高,仅15%-20%的动物造模成功。BMSCs源神经干细胞移植后可在海马内存活,向周围的脑区内迁移和整合。结论BMSCs源的神经干细胞在体外可诱导为γ-氨基丁酸能神经元并且对慢性癫痫有一定的治疗作用。     

胰腺十二指肠同源框-1基因促进大鼠骨髓间充质干细胞分化为胰岛样细胞

虽然骨髓间充质干细胞(BMSCs, bone marrow mesenchymal stem cells)具有极强的自我更新能力及多向分化潜能, 但最近发现其体外分化为胰腺内分泌细胞的效率并不高, 不能产生足够用于移植的胰岛样细胞. 胰腺十二指肠同源框-1基因(Pdx-1, pancreatic duodenal homeobox-1)在胰腺胚胎发育和胰岛素基因表达调控方面均具有重要作用, 因此构建含有Pdx-1的真核表达载体, 并使用新型纳米介质Superfect介导重组载体转染BMSCs, 研究Pdx-1表达在BMSCs体外分化为胰岛样细胞中的作用. 结果表明, 转染重组载体后(Pdx-1⁺ BMSCs)分化为胰岛素阳性细胞比例为(28.23±2.56)%, 较转染空白载体和未转染组(Pdx-1-BMSCs)明显增多(分别为(7.08±2.69)%和(4.59±3.02)%); 细胞免疫化学染色显示诱导后细胞表达胰岛素、胰高血糖素和生长抑素蛋白, 而且Pdx-1⁺ BMSCs诱导后表达明显增加, 与Western blotting和RT-PCR结果相似; 葡萄糖诱导的胰岛素分泌量测定显示Pdx-1⁺ BMSCs对不同浓度葡萄糖有不同的胰岛素分泌, 25和5.5 μmol/L葡萄糖刺激后胰岛素分泌量分别为(115.29±2.56)和(56.61± 4.82) μU/mL, 明显高于Pdx-1^- BMSCs分泌量(分别为(53.26±7.56)和(25.53±6.49) μU/mL). Pdx-1⁺ BMSCs分化的细胞同种异体移植后可以恢复糖尿病模型大鼠的血糖水平, 移植物平均存活时间(30.5±15.7)天. 本试验提示大鼠BMSCs体外能分化为胰岛样细胞; Pdx-1能显著增强上述分化能力; BMSCs体外分化的胰岛样细胞移植能改善STZ糖尿病大鼠的生存状态. 这将为糖尿病的治疗提供一条新的途径.     

Nurr1基因、AAV载体在帕金森病基因治疗的可能应用

Nurr1属于孤儿核受体家族,目前认为它对中脑多巴胺能神经元的发育、存活和成熟后的表型维持发挥重要作用。Nurr1基因可以提高多巴胺转运体(DAT)基因和酪氨酸羟化酶(TH)基因的转录。在人类,与年龄相关的DA表型标志物TH的降低与黑质部位Nurr1表达的下调有关。Nurr1有望成为帕金森病基因治疗的候选基因。腺病毒伴随病毒(AAV)是目前公认的较有希望的病毒载体,它可以感染非分裂细胞,由AAV-Ⅱ型改造的重组AAV载体可以定点整合于宿主细胞染色体,可以特异性感染神经元,适合对中枢神经系统的治疗。重组AAV应该是能够良好携带Nurr1基因进行帕金森病基因治疗的载体。     

川芎嗪体外诱导小鼠骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞的研究

为了探讨川芎嗪体外诱导小鼠骨髓间质干细胞（BMSCs）分化为神经元样细胞的作用,以小鼠骨髓间充质干细胞为研究对象,实验分为空白对照组、β-巯基乙醇（BME）阳性对照组和川芎嗪诱导组。采用荧光免疫化学和Western blot方法,分别检测神经干细胞巢蛋白（nestin）和经元特异性烯醇化酶（NSE）的表达;RT-PCR检测诱导不同时间对神经细胞相关基因Nestin、NSE、β-微管蛋白III（β-Tubulin III）和核受体相关因子-1（Nurr1）mRNA表达的影响。结果显示川芎嗪诱导间充质干细胞24 h后,细胞形态发生显著改变,细胞突起形成且数目不等,形成神经元样细胞。细胞死亡率低于β-巯基乙醇诱导组。免疫荧光化学法和western blot结果显示：川芎嗪诱导后的细胞nes-tin和NSE蛋白表达呈阳性,且表达丰度显著高于β-巯基乙醇诱导组。川芎嗪作用不同时间的BMSCs表达神经细胞相关基因Nestin、β-Tubulin III、NSE和Nurrl。结果表明川芎嗪能定向诱导小鼠骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞,是较理想的诱导剂。     

大鼠骨髓间充质干细胞向神经细胞分化后自噬水平的变化

目的:探讨骨髓间充质干细胞(BMSCs)向神经细胞分化前后自噬水平的变化,进一步研究BMSCs神经分化机制。方法:原代培养大鼠BMSCs,三代后用L-DMEM(2%DMSO+200μmol/L BHA)诱导其向神经细胞分化,采用免疫细胞化学方法检测神经元特异标记物NSE表达,采用RT-PCR方法检测自噬相关基因LC3B、Beclin1、Atg5、Atg7、Atg10的表达,用Western blot及流式细胞术检测了自噬标志蛋白LC3B的表达。结果:大鼠BMSCs传3代后,贴壁的BMSCs可达90%以上,类成纤维细胞样梭形生长,经诱导剂作用5 h后,细胞呈现神经细胞样改变,NSE阳性率为(83±5)%。RT-PCR结果表明BMSCs向神经细胞分化后LC3B,Beclin1,Atg5,Atg7,Atg10的表达升高,流式细胞术检测LC3B的平均荧光强度升高,Western blot结果表明神经分化后LC3B-Ⅱ表达增加。结论:大鼠BMSCs向神经细胞分化后自噬水平增加。     

抗坏血酸对IL-1β体外诱导中脑神经干细胞分化为酪氨酸羟化酶阳性神经元作用的实验研究

目的体外观察抗坏血酸(ascroid acid,AA)对IL-1β诱导神经干细胞向酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase,TH)阳性神经元分化的作用,为帕金森病的细胞移植治疗提供实验资料.方法体外培养中脑神经干细胞并传代分组,在有血清条件下分别予以IL-1β及AA IL-1β诱导分化,TH免疫细胞化学鉴定分化结果并细胞计数阳性比例.结果有血清条件下IL-1β、AA IL-1β诱导中脑神经干细胞分化为TH阳性神经元比例约为12.6%和14.3%,明显高于对照组(约2.6%,P<0.01);两实验组间相对无统计学差异(P>0.05);联合诱导组TH阳性神经元细胞形态更成熟.结论 IL-1β可以明显促进中脑神经干细胞分化为TH阳性神经元,AA能够加强IL-1β诱导的TH阳性细胞的表型成熟,但在我们的实验条件下二者联合未能增加TH阳性细胞诱导率.     

Lactacystin诱导帕金森病大鼠黑质胶质细胞的变化

目的观察蛋白酶体抑制剂Lactacystin诱导大鼠黑质胶质细胞的变化、炎性介质NF-κB的表达。方法采用立体定向术将蛋白酶体抑制剂Lactacystin 10μg注射至大鼠黑质部位,免疫组织化学法观察黑质区多巴胺(DA)能神经元、小胶质细胞、星形胶质细胞的变化,炎性介质核转录因子κB(NF-κB)的表达。结果注射Lactacystin 3周,阿朴吗啡腹腔注射后出现典型旋转行为;8周后实验组大鼠损毁侧黑质酪氨酸羟化酶(TH)阳性细胞数明显减少,黑质小胶质细胞及星形胶质细胞的数量均增加,NF-κB表达增强。结论蛋白酶体抑制剂Lactacystin能激活大鼠黑质小胶质细胞及星形胶质细胞,诱导炎性介质表达。