水牛MyD88cDNA的克隆与原核表达

采用RT-PCR方法从水牛外周血白细胞总RNA中扩增出髓样分化因子88 (mydoid differentiation factor 88,MyD88) cDNA序列,PCR产物分离纯化后,与pMD20-T载体连接,重组质粒经PCR、酶切鉴定后测序,并进行生物信息学分析;构建pET28a-MyD88表达载体,并将其转化至E.coli BL21 (DE3),经IPTG诱导表达后,进行SDS-PAGE、镍柱亲和层析纯化和Western blotting分析.结果显示,克隆到的水牛MyD88 cDNA全长为1 189 bp,含有1个891 bp的开放阅读框,编码296个氨基酸,理论等电点为5.65.经IPTG诱导表达后,得到一个带His·Tag的约39 kD的重组融合蛋白.用抗His单克隆抗体进行Western blotting,得到1条约39 kD特异性抗体结合带,表明水牛MyD88原核表达载体成功构建并表达.本研究为进一步开展水牛MyD88的结构功能分析奠定了基础.     

林麝γ-干扰素基因的克隆、分析及表达、纯化

以RT-PCR方法,从经ConA诱导的林麝（Moschus berezovskii）外周血淋巴细胞（peripheral blood mononuclear cells,PBMC）总RNA中扩增出编码林麝IFN-γ的基因并将其克隆到pMD18-T载体上。经筛选、菌落PCR鉴定、测序、序列分析,证实为林麝IFN-γ基因编码序列（全长498bp）。将其重组到原核表达载体pGEX4T-1,并在大肠杆菌BL21中实现了高效表达。表达产物以GST（Glutathione S-transferase）融合蛋白的形式存在,表达量约占细菌总蛋白的26．9％。经NaOH法变性复性后,用GSTrap亲和柱对蛋白进行了纯化。本研究成果为进一步研究林麝IFN-γ的生物学活性及其临床应用奠定了基础． 对林麝异地保护具有重要意义。     

拟南芥蛋白磷酸酶TOPP4的原核表达和多克隆抗体纯化

以拟南芥野生型Col-0为材料,对其I型蛋白磷酸酶(TOPP)家族进行序列分析,对家族成员之一的TOPP4进行原核表达及多克隆抗体的制备和纯化。结果显示:(1)该研究构建出原核表达载体pEGM-4T-3-TOPP4和pET-28a-GFP-N150并转入大肠杆菌BL21(DE3)中。(2)经IPTG诱导,表达出分子量约为62kD的GST-TOPP4和分子量约为34kD的His-GFP-N150可溶性重组蛋白。(3)纯化的重组蛋白GST-TOPP4作为抗原免疫新西兰兔后,获得了效价大于1∶400 000的多克隆抗体血清。(4)抗体血清经连接了His-GFP-N150蛋白的溴化氢活化的树脂纯化,得到特异性较高的anti-TOPP4多克隆抗体。研究认为,该研究纯化出了特异的TOPP4蛋白多克隆抗体。     

奥利亚罗非鱼促性腺激素释放激素前体蛋白的克隆与表达

促性腺激素释放激素（gonadotropin—relying hormone,GnRH）是下丘脑分泌产生的神经激素,对脊椎动物生殖的调控起重要作用。为研究GnRH对性腺发育的作用,构建了GnRH cDNA的原核表达载体并进行融合表达。利用RT—PCR方法从奥利亚罗非鱼丘脑中扩增出长约400bp的目的序列GnRH基因,克隆至T载体中,经酶切鉴定和序列测定分析确认序列的正确性后将此片段克隆到表达载体pMAL—c2x中构建重组表达质粒pMAL—GnRH,并在大肠杆菌TB1中获得了高表达,目的蛋白约占菌体总蛋白的41．6％。菌体经溶菌酶裂解,制备无细胞抽提液,Amylose—sepharose柱层析后得到分子量为56kD单一条带的目的蛋白。目的蛋白经Factor Xa酶切裂解,Amylose—sepharose过柱纯化后得到纯化的GnRH前体蛋白。该研究为鱼类GnRH蛋白的控制性腺成熟和抗体制备打下了基础．是国内鱼类GnRH前体蛋白在原核细胞中成功表扶的首次报道．     

表皮生长因子受体干扰序列与白细胞介素24融合蛋白的原核表达

目的：在大肠杆菌中表达表皮生长因子受体干扰序列（EGFRi）与白细胞介素24（IL-24）的融合蛋白。方法：人工合成肿瘤细胞表面受体特异性结合位点EGFRi核苷酸序列,应用重叠延伸PCR技术将其与IL-24基因连接,其间引入一段柔软短肽编码基因;将融合基因克隆入pET-22b原核表达载体,IPTG诱导融合蛋白在大肠杆菌BL21（DE3）中表达,对表达条件进行优化;用His·Bind纯化试剂盒对表达产物进行纯化,SDS-PAGE进行鉴定。结果：酶切和测序结果证实EGFRi-IL-24融合基因的原核表达载体构建正确;在IPTG浓度为0.8mol／L、28℃诱导10h的条件下,可溶性融合蛋白表达量最高;表达产物的相对分子质量与预期值一致,为22000;经纯化得到了均一的融合蛋白。结论：获得大肠杆菌表达的融合蛋白EGFRi-IL-2,可用于活性分析。     

烟实夜蛾脂肪酸结合蛋白基因的克隆、序列分析与表达

应用RT-PCR技术,从烟实夜蛾Helicoverpa assulta幼虫脂肪体组织和血细胞总RNA中反转录扩增脂肪酸结合蛋白(fatty-acid binding protein,FABP)基因的cDNA片段,克隆到原核表达载体pGEX-4T-2上,转化大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG进行诱导表达并进行检测。结果表明：扩增得到的片段全长399 bp(GenBank登录号为DQ299942),编码132个氨基酸残基,预测分子量15.0 kD,等点电5.83。FABP融合了GST。原核表达后经电泳检测到约41 kD大小的外源蛋白,Western blot检测表明是目的蛋白。     

猪尿酸氧化酶在大肠杆菌中的表达、纯化与部分酶学性质分析

本研究报道了猪尿酸氧化酶(Porcine urate oxidase,pUOX)的原核表达载体的构建、pUOX的蛋白表达条件的优化以及对pUOX经纯化后进行活性检测和酶学性质分析。利用RT-PCR从猪肝总RNA中克隆pUOX,定向插入原核表达载体pET30a(+)中,构建表达载体pET30a(+)/pUOX,并转化到大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)中。重组质粒pET30a(+)/pUOX经双酶切鉴定和序列分析,证实已成功构建了重组表达载体。重组表达菌经IPTG诱导表达了约为41kD的蛋白,与预期分子量一致,并对pUOX蛋白表达条件进行了优化,表达的蛋白主要以包涵体的形式存在于细胞中,包涵体经过变性、复性后,用Ni2+-NTA对复性蛋白进行亲和纯化,并对纯化蛋白进行了活性检测和酶学性质分析,纯化的重组pUOX的比活为50.63IU/mg,并发现重组蛋白在最佳温度、热稳定性等方面与天然pUOX相同,为后续动物实验奠定重要的基础。     

乙型肝炎病毒DNA聚合酶反式调节蛋白HBVDNAPTP1的表达、纯化与初步鉴定

目的构建HBVDNAPTP1基因的原核表达载体,诱导其在大肠埃希菌中表达,并对融合蛋白进行纯化。方法利用逆转录-PCR获得乙型肝炎病毒(HBV)DNA聚合酶(Polymerase)反式调节人类新基因HBVD-NAPTP1,测序正确后插入至原核表达载体pET-32a(+)中,转化BL21(DE3)宿主菌进行诱导,并利用组氨酸亲和层析方法对融合蛋白进行纯化。结果 HBVDNAPTP1原核表达载体转化宿主菌后,经0.5 mmol/L IPTG、30℃诱导5 h获得了分子量约为31 kD的HBVDNAPTP1融合蛋白的优化表达,Western blotting证实融合蛋白的特异性。亲和层析纯化后得到较纯的HBVDNAPTP1融合蛋白,每升培养菌液中可获得2.24 mg的纯化蛋白。结论成功获得纯化的HBVDNAPTP1融合蛋白,为今后开展HBVDNAPTP1的生物学功能研究奠定了物质基础。     

人LRG1基因的原核表达及生物信息学分析

为了探讨LRG1基因结构与功能,对该基因进行克隆并构建到原核表达载体上,并对其进行表达及生物信息学分析。用Trizol法提取人肝癌HepG2细胞总RNA后,PCR扩增得到LRG1片段,经鉴定后将目的基因与原核表达载体pET28a连接,经诱导表达获得His-LRG1蛋白。LRG1基因cDNA片段大小为1 044 bp,编码347个氨基酸;成功构建pET28a原核表达载体,经多次不同条件诱导后,得到大小约40 kD目的蛋白;利用软件对LRG1蛋白的一级、二级结构进行了预测,分析总结得LRG1基因编码的蛋白是一个不稳定且具有亲水性的蛋白,可与多种信号开关相互作用。LRG1属于高度保守的富亮氨酸重复家族成员,其原核表达载体不易诱导产生大量目的蛋白,克隆表达该基因有利于验证其结构与功能关系。     

水稻YTB中OSVDAC5蛋白的原核表达与抗体制备

目的:克隆水稻YTB osvdac5基因,原核表达后获得纯化的OSVDAC5蛋白,制备相应的抗体.方法:采用Trizol法提取水稻总mRNA,反转录为cDNA,通过PCR扩增得到该基因与原核表达载体连接,构建重组质粒pET-30a-osvdac5,并转入大肠杆菌进行原核表达,SDS-PAGE检测表达产物.通过镍柱纯化获得的单一目的蛋白用于抗体制备,用Western Blot检测抗体的特异性.结果:克隆到原核表达载体中osvdac5基因的ORF为813 bp,编码271个氨基酸.在大肠杆菌中15℃、0.7mmol/L的IPTG浓度诱导17 h是pET-30a-osvdac5融合蛋白表达的优选条件,表达的OSVDAC5蛋白属于包涵体蛋白.镍柱纯化后的OSVDAC5为30 kD左右的单一条带.Western Blot分析表明,抗体能够与30 kD处的OSVDAC5蛋白进行特异性结合.结论:成功克隆了水稻YTB osvdac5基因,原核表达蛋白OSVDAC5制备的多免隆抗体具有一定特异性,能与免疫抗原结合,这为进一步研究OSVDAC5蛋白在植物不同生长发育时期中的表达模式奠定了基础.     

安徽麝线粒体DNA细胞色素b基因全长序列分析

自80年代安徽麝[Moschus (moschiferus/berezovskii)anhuiensis]被发现以来,其分类地位一直众说纷纭。在本研究中,我们对安徽麝模式皮张标本进行了线粒体DNA细胞色素b基因全长序列分析。研究结果表明,安徽麝同麝属中其他种的遗传分化已经相当明显.分子系统学的分析表明,安徽麝是一个单系群,它同麝属其他种的DNA序列差异已达到种间分化的程度。因此,线粒体DNA序列的证据支持将安徽麝列为麝属中一有效种（Moschus anhuiensis),而不是前人认为的原麝或林麝的亚种。     

林麝及马麝SRY基因片段克隆及其在系统进化分析中的应用

根据已报道的偶蹄目动物并参照人和狗SRY基因碱基序列设计一对简并引物,以林麝(Moschus berezovskii)及马麝(M．chrysogaster)基因组DNA为模板,通过PCR扩增出SRY基因CDS区。克隆的林麝及马麝SRY基因片段经测序,其长度为684bp。从父亲遗传角度出发,利用GenBank中收录的18种偶蹄目SRY基因,用邻位相接法(NJ)和最大简约法(MP)分别构建了鹿科、牛科和麝科的系统进化树。聚类树显示麝形成一个单系,支持麝作为独立一科的观点。     

四川围栏养殖林麝采食植物种类调查

对四川都江堰人工养殖围栏内林麝采食的野生及栽种植物种类进行调查.结果表明,围栏内共有林麝采食植物64种,隶属于31科,多属于农田野草、野菜,少数是栽种的饲草、树木.分析了林麝采食利用植物的特点及这些植物作为饲料在生产中的潜在应用价值.     

近50年陕西凤县林麝分布区的变迁

于2005年夏季和2006年春季,采用问卷调查结合野外实地验证,对陕西风县林麝(Moschus berezovskii)的现时及历史分布进行了分析,并将所得分布信息叠加至数字化地图,绘制成林麝近50年的分布区变迁图.结果表明:历史上,凤县是秦巴山区林麝的主要分布区之一,从20世纪80年代初开始,该县林麝数量大幅下降,至今分布区已严重萎缩并破碎化,总分布面积减少至50年前的1/3;目前林麝分布区主要在相对偏远、人为干扰较少的乡与乡的交界和县的边缘地区,分布区被人类聚居地及主要公路所隔离.造成这种现状的主要原因是过度捕杀、森林减少及道路建设.     

林麝促卵泡激素和促黄体激素基因的克隆及其序列分析

林麝FSHB和LHβ基因是调控林麝的繁殖和泌香的重要垂体激素.本研究克隆了林麝FSHβ和LHβ基因DNA全序列,林麝FSHβ和LHβ基因与其他反刍动物相似,具有3个外显子区域;哺乳动物FSHβ和LHβ全基因序列的差异大于外显子之间的差异.在哺乳动物中,林麝FSHβ和LHβ蛋白序列与人、马同源性并不是最高,因此,在林麝的催情、人工授精以及用于二次催香反应中应考虑使用相似性更高的激素或自生激素以减少人工繁殖和泌香失败.     

金黄色葡萄球菌肠毒素 C2 的基因克隆、 表达及其生物学活性

利用 PCR 技术从金黄色葡萄球菌的基因组 DNA 中克隆 SEC2 全长基因, PCR 产物与 pGEM-T 载体连接,经测序证实后进行亚克隆,构建其表达载体 pET-28a-SEC2 ,在大肠杆菌 BL21(DE3) 中表达成熟重组蛋白 (rSEC2) , 纯化 rSEC2 蛋白并对其生物学活性进行研究 . 结果表明：成功克隆了 SEC2 全长基因,测序证实该基因共 717 bp ,编码 239 个氨基酸,与 GenBank 中收录的 SEC2 成熟蛋白质序列完全一致, SEC2 基因登录 GenBank(Accession number ： AY450554) ; 构建了 SEC2 的表达载体 pET-28a-SEC2 ,并在大肠杆菌 BL21(DE3) 中得到高效可溶性表达,可溶性的 rSEC2 经 Ni²⁺ 亲和层析纯化达到电泳纯,纯化的 rSEC2 蛋白经蛋白质印迹检测,并能有效刺激人外周血单个核细胞的增殖,被 rSEC2 刺激的外周血单个核细胞在体外对肿瘤细胞的生长有显著的抑制作用 .     

林麝微卫星座位的分离和鉴定

利用改进的磁珠富集法从林麝(Moschus berezovskii)的基因组中分离到10个新的(AC)n重复微卫星座位,并分析其在24个林麝个体(取样于中国四川金凤山群体)中的多态性。其中,5个位点在24个林麝个体中具有4—13个等位基因,观察杂合度和期望杂合度分别是0.429—0.957和0.587—0.902,平均多态信息含量是0.730。表明这5个微卫星位点具有高度的多态性,可以用于林麝遗传多样性研究,对林麝的保护具有很重要的意义。     

增强型绿色荧光蛋白在集胞藻6803中的表达

利用聚球藻7942热休克基因groESL的启动子和报告基因egfp,构建了表达载体pUC-Tegfp并转化集胞藻6803,并通过所制备抗体对转基因藻进行蛋白免疫印迹检测.结果发现,在转基因藻株T-egfp的细胞粗提液中含有能与eGFP抗体特异结合的蛋白质,表明外源增强型绿色荧光蛋白基因(egfp)在集胞藻6803中成功表达.     

新城疫病毒F蛋白在昆虫细胞中的表达及其融细胞作用

用RT-PCR方法扩增出新城疫病毒标准强毒株F48E8的F基因,并将其克隆到pGEM-T载体,命名为pGEM-NDF。鉴定正确后,以BamHI和XbaI双酶切将F基因从pGEM-NDF中释放出来,并插入到pFastBacI载体中,得到重组转移载体pFast-NDF。然后将该重组质粒转入含有穿梭质粒的感受态DH10Bac中,通过转座作用获得重组穿梭质粒reBacmid-NDF。再用reBacmid-NDF转染Sf9昆虫细胞,获得含有新城疫病毒F48E8株F基因的重组杆状病毒。间接免疫荧光和Western-blot分析结果表明F蛋白在昆虫细胞中获得表达,而且主要表达于细胞膜上,并使感染重组杆状病毒的昆虫细胞在96h发生融合作用。动物试验表明,表达的F蛋白能够产生中和抗体。本文的研究结果为F蛋白的进一步开发奠定了基础。     

人白细胞介素-10在大肠杆菌中的克隆与表达

目的:构建人IL-10原核表达载体,并对表达产物进行鉴定。方法:应用RT-PCR技术从ConA诱导的单核细胞中扩增出IL-10成熟肽cDNA片段,将其克隆到PGEM-T后载体测序,双酶切回收目的片段构建IL-10原核表达载体PET28a-IL10。PET28a-IL10转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达后对其表达产物进行SDS-Page和Western Blot分析。结果:SDS-Page电泳显示IL-10在大肠杆菌中得到了表达,分子量为21000,Western Blot分析显示表达产物可于IL-10多抗特异反应。结论:IL-10在大肠杆菌中成功表达,具有免疫原性。为其进一步生物学研究奠定了基础。