CpG甲基化与基因调控

CpG双核苷酸中的胞嘧啶甲基化和去甲基化在哺乳动物的基因表达中有重要的调控作用.哺乳动物基因组中有两类启动子:CpG岛启动子和CpG缺乏启动子.两种蛋白质因子通过与甲基化CpG的相互作用影响基因表达,CpG岛在基因组分析中也有广泛的用途.     

可溶性核糖核酸的研究 Ⅲ.酵母可溶性核糖核酸中抗碱二核苷酸的分离与鉴定

利用Tomlinson和Tener的DEAE-纤维素柱层析方法,我们从酵母SRNA的碱水解产物分得抗碱二核苷酸的层析峰。将抗碱二核苷酸混合物用大肠杆菌碱性磷酸单酯酶处理后,纸层析分离可得到四个部分,分别称A_1,A_2,A_3及A_4。经鉴定A_1为2′-O-甲基鸟便嘌呤核苷-3′-磷酸-5′-鸟便嘌呤核苷(G'pG),A_2主要为2′-O-甲基胞嘧啶核苷-3′-磷酸-5′-鸟便嘌呤核苷(C'pG,纯度约为87%),A_3则至少合2′-O-甲基胞嘧啶核苷-3′-磷酸-5′-腺嘌呤核苷(C'pA)和2′-O-甲基鸟便嘌呤核苷-3′-磷酸-5′-腺嘌呤核苷(G'pA),A_4较为复杂,未最后鉴定。因此酵母SRNA中至少含有下列四种抗碱二核苷酸:2′-O-甲基鸟便嘌呤核苷-3′-磷酸-5′-鸟便嘌呤核苷酸(G'pGp),2′-O-甲基胞嘧啶核苷-3′-磷酸-5′-鸟便嘌呤核苷酸(C'pGp),2′-O-甲基胞嘧啶核苷-3′-磷酸-5′-腺嘌呤核苷酸(C'pAp)及2′-O-甲基鸟便嘌呤核苷-3′-磷酸-5′-腺嘌呤核苷酸(G'pAp)。除此以外,还得到核苷二磷酸的层析峰,其中主要为鸟便嘌呤核苷-2′(3′),5′-二磷酸,只有少量的腺嘌呤核苷-2′(3′),5′-二磷酸。     

香蕉果实特异性ACC合酶的cDNA克隆及序列分析

根据ACC合酶高度保守区氨基酸序列设计两种兼并引物。通过RTPCR,克隆了香蕉果肉ACC合酶1693bp的cDNA片段。再根据其序列测定结果进行5′RACE(RapidamplificationofcDNAends)。最终确定香蕉果肉中ACC合酶的mRNA全长为1752个核苷酸。其中5′非翻译区74个核苷酸,编码区1461个核苷酸,3′非翻译区217个核苷酸,编码产物为486个氨基酸。通过Northern杂交分析,证明此ACC合酶基因的表达具有果实特异性     

利用~1H-NMR模拟谱研究三核苷酸A3′P(CH_3)5′A3′P(CH_3)5′A的构象性质

根据Altona等人的方法.利用~1H—NMR模拟谱分析了A3′P(CH_3)5A3′P(CH_3)5′A的三种非对映异构体:a、b和C的构象状态.发现:在室温下三个核糖环都是S型构象占优势(X_N≤0.44),而且随温度升高S型构象成分增多;两个二核苷酸片段-PAPA和APAP-的磷酸骨架扭角分别与A3′P(CH_3)5′A两种异构体a或b数值接近.差值约5°左右;二核苷酸片段中核糖环的重叠程度与手性磷原子的构型有关、R构型比S构型的核糖环重叠程度小;从而推测,A3′P(CH_3)5′A3′P(CH_3)5′A各种非对映异构体的稳定性为RR>RS.SR>SS,与化学合成中所见相符合.     

蓖麻蚕5.8S rRNA基因的结构特点

利用计算机分析已知的蓖麻蚕(Attacus ricini)5.8S rRNA顺序,发现其上有一个PstⅠ位点。因此,将rDNA上PstⅠ位点两侧的DNA片段分别克隆在pWR 13质粒上。用末端终止法测定了蓖麻蚕5.8S rRNA基因全顺序及与之相邻的上、下游部分核苷酸顺序。发现5.8SrRNA基因3′端为pGGGCCGGCT_(OH)。这个结果与Feng,Y.X.等报道的蓖麻蚕5.8S rRNA顺序3′端是pGGGCCGAUUAA_(OH)有两个明显不同:第一,从共同顺序pGGGCCG算起,5.8S rRNA基因的3′端有九个核苷酸,比Feng Y.X.等报道的rRNA顺序3′端少两个核苷酸;第二,两者在3′末端共同顺序以后的两个核苷酸是不一样的。此外,还发现在蓖麻蚕5.8S rRNA基因上游有一个约30个核苷酸的poly(A)区。     

编码酵母丙氨酸tRNA两个半分子的DNA的克隆

用DNA合成仪合成寡聚脱氧核苷酸。用T4-DNA连接酶把这些寡聚脱氧核苷酸重组成双链DNA。这两个双链DNA的上游是T7-启动子,下游分别编码酵母丙氨酸tRNA的5′半分子(1-35位核苷酸)和3′半分子(35-76位核苷酸)。再把这两个双链DNA克隆到PUC 12质粒中。经点杂交筛选和DNA顺序测定证明克隆是成功的。     

奶牛产奶性状与乳房炎相关基因CpG含量及分布特征的比较分析

DNA甲基化是表观遗传学的重要组成部分,基因启动子区及第一外显子区的CpG甲基化通常抑制该基因的表达,而去甲基化则促进基因表达。已有的研究发现荷斯坦牛的乳房炎指标SCC(Somatic cell count)与产奶量呈较强负相关。文章分析并比较了这两类性状的相关基因的启动子区、第一外显子、下游2 000 bp序列中CpG含量及分布特征。结果表明,乳房炎相关基因的启动子、第一外显子中CpG含量显著低于产奶性状相关基因,而两类性状基因下游2 000 bp序列中CpG含量无显著性差异。另外,文中提出了两个量化基因序列中CpG特征的指标,一个是CpG平均距离,用来衡量序列中的CpG分布;另一个是条件概率p(G|C),用以量化序列中二核苷酸CpG随碱基C出现的可能性,并对两类基因的启动子和第一外显子区域的这两个指标做了统计检验。研究结果对产奶性状与乳房炎相关基因的DNA甲基化调控研究奠定了基础。     

肺癌与DNA 甲基化研究的进展

DNA甲基化是表观遗传学研究的重要内容。其本质是在甲基转移酶的催化下,DNA的CG两个核苷酸的胞嘧啶被选择性地添加甲基,形成5’甲基胞嘧啶的过程。CpG岛是DNA甲基化常发生的部位。CpG岛指基因组中长度为300～3000 bp的富含CpG二核苷酸的一些区域,主要存在于基因的5’区域。以往的研究表明,肺癌的发生常与CpG岛的异常甲基化有关。多基因异常的甲基化常为肿瘤发生的重要机制。近年来,研究比较热门的基因有p16、RASSF1A、CDH1、CDH13、FHTI、TMS1/ASC等。研究集中在肺癌组织与癌旁组织甲基化频率的统计分析,以及对于血液,痰液,肺泡灌洗液发生甲基化频率的统计分析。对于肺癌相关抑癌基因甲基化的研究,为肺癌患者的早期诊断提供思路,并为治疗开辟新的方向。去甲基化治疗虽研究较少,但目前已取得一定进展。     

结直肠癌中DNA甲基化研究进展

CpG岛是人类基因组中富含CpG二核苷酸的DNA序列,主要位于基因启动子区,大小约为100-1000bp,与约60％编码基因相关。DNA中CpG岛甲基化可导致抑癌基因的表观遗传学转录失活,直接参与肿瘤的发生机制。近年来,甲基化已成为表观遗传学研究的焦点。我们简要综述了DNA甲基化在结直肠癌中的研究进展。     

肺炎克氏杆菌(Klebsiella pneumoniae)中的二种不寻常核苷酸的酶促合成和鉴定

我们用肺炎克氏杆菌的粗酶制剂研究了腺苷多磷酸化合物的酶促合成。在用30～50%饱和度硫酸铵沉淀蛋白进行的反应中,发现了二个化合物。经鉴定证明这二个化合物分别是A~5′ppp~5′A和A~5′pppp~5′A。本文还报道了一种制备α-~(32)P标记核苷酸的方法。     

肺炎克氏杆菌(Klebsiellapneumoniae)中的二种不寻常核苷酸的酶促合成和鉴定

我们用肺炎克氏杆菌的粗酶制剂研究了腺苷多磷酸化合物的酶促合成。在用30～50%饱和度硫酸铵沉淀蛋白进行的反应中,发现了二个化合物。经鉴定证明这二个化合物分别是A~5′ppp~5′A和A~5′pppp~5′A。本文还报道了一种制备α-~(32)P标记核苷酸的方法。     

我国禽脑脊髓炎病毒分离株全基因组的测定

测定了我国禽脑脊髓炎病毒(avian encephalomyelitis virus,AEV)分离株L2Z株的全基因组核苷酸序列.该病毒株的3′和5′非编码区核苷酸序列用3′和5′RACE(cDNA末端快速扩增)法获得.基因组全长为7 059个核苷酸残基,包括494个核苷酸残基的5′非编码区、6 402个核苷酸残基的开放阅读框和136个核苷酸残基的3′非编码区及poly(A)尾巴.与已发表的AEV疫苗株1 143的基因组序列比较发现,它们之间核苷酸和氨基酸的同源性分别为98%和97.6%.结构蛋白(VP1～VP4)中,主要宿主保护性免疫原蛋白VP1氨基酸之间差异较小.与小RNA病毒科其它病毒属相比,在非结构蛋白3D中,预测的8个RNA依赖性RNA聚合酶主要结构域中的4个高度保守.从而进一步确认了AEV的分子特性.     

以CpG为佐剂的犬细小病毒基因疫苗的初步研究

目的研制犬细小病毒(CPV)基因疫苗。方法以CPV VP2基因为基因免疫的目的基因,以pcDNA3和pcDNAK质粒为基因免疫的载体,以非甲基化的胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸(CpG)为核心的免疫刺激序列为免疫佐剂,构建重组质粒并免疫BALB/c小鼠和毕格犬。结果经pcDNA3-VP2C1(含1个拷贝CpG基序)基因免疫的BALB/c小鼠能产生抗CPV血凝抑制抗体;对于经CPV灭活苗初次免疫的毕格犬,用pcDNAK-VP2C2(含2个拷贝CpG基序)质粒免疫产生的再次免疫应答优于pcDNA3-VP2C1。结论VP2基因、pcDNAK和犬源CpG可用于CPV基因疫苗的进一步研究。     

丙型肝炎病毒5′-非编码区及其结合蛋白的研究进展

丙型肝炎病毒(HCV)RNA5′-非编码区(5′-NTR)由341个核苷酸组成,形成4个茎-环二级结构,5′-NTR二级结构及某些部分单链序列的核苷酸组成是病毒翻译起始的先决条件.5′-NTR中的大部分核苷酸序列组成内部核糖体进入位点(IRES),在宿主细胞蛋白质因子La自身抗原、eIF3、多聚嘧啶区结构蛋白(PTB)、多聚胞嘧啶结合蛋白(PCBP-1、2)等的作用下,形成复杂的翻译起始复合物,对HCV的翻译过程进行精确调控,完成帽状结构形成非依赖性的蛋白翻译过程.HCV RNA 5′-NTR翻译过程的分子生物学机制的研究,将有助于HCV治疗新方法和新途径的探索.     

丙型肝炎病毒5

丙型肝炎病毒(HCV)RNA5′-非编码区(5′-NTR)由341个核苷酸组成,形成4个茎-环二级结构,5′-NTR二级结构及某些部分单链序列的核苷酸组成是病毒翻译起始的先决条件.5′-NTR中的大部分核苷酸序列组成内部核糖体进入位点(IRES),在宿主细胞蛋白质因子La自身抗原、eIF3、多聚嘧啶区结构蛋白(PTB)、多聚胞嘧啶结合蛋白(PCBP-1、2)等的作用下,形成复杂的翻译起始复合物,对HCV的翻译过程进行精确调控,完成帽状结构形成非依赖性的蛋白翻译过程.HCV RNA 5′-NTR翻译过程的分子生物学机制的研究,将有助于HCV治疗新方法和新途径的探索.     

微生物未甲基化CpG DNA对动物肠道的免疫调节作用

摘要:微生物未甲基化CpG DNA为富含未甲基化胞嘧啶-鸟嘌呤二核苷酸的DNA片段,能够被动物肠道细胞Toll样受体家族中的TLＲ9 受体(Toll-like receptor 9,TLR9)特异性识别。未甲基化CpG DNA作为一种动物肠道免疫刺激因子,不仅能够直接调节肠道固有免疫应答,同时还能间接介导肠道适应性免疫应答。未甲基化CpG DNA具有调节机体免疫应答作用的应用前景,成为免疫佐剂开发的研究热点。本文主要综述微生物未甲基化CpG DNA基本概念、受体TLR9的特征、调节动物肠道免疫作用及其信号机制,同时阐述了未甲基化CpG DNA作为免疫佐剂在实际中的应用,最后对微生物未甲基化CpG DNA研究与开发利用前景进行了展望。     

mRNA翻译起始区构效关系的研究

本文分析了9个表达量相差55倍的5′PCNA-LacZ′重组子的TIR二级结构与翻译起始效率的关系。在5′NTR顺序确定为28个核苷酸(从转录起始位点起)时,TIR范围在约编码第12个密码子(第33至37核苷酸)处存在一个二级结构及其△G的变化阈位,在该阈位处按表达量调正重组子TIR的范围,得到△G与表达量之间相关系数为0.97的曲线;在TIR二级结构中,起始密码子处于配对的空间位置对翻译起始效率有明显抑制作用,但SD顺序的空间位置与表达量之间无明显相关性。     

鸡二价金属转运蛋白1 cDNA的克隆与序列分析

鸡二价金属转运蛋白1（divalent metal transporter 1, DMT1）在动物胃肠道锰吸收过程中起重要作用.根据哺乳动物Dmt1同源蛋白氨基酸序列的保守性设计引物,应用3′RACE(rapid amplification of cDNA ends)技术,扩增并克隆获得鸡小肠Dmt1 cDNA 3′端1 289bp和1 092bp的2种片段,发现其3′端翻译区和非翻译区存在差异. 根据鸡Dmt1 cDNA 3′端片段的测序结果设计引物,扩增获得1个与3′端片段部分重叠的鸡Dmt1 cDNA 5′端907 bp片段,并对其进行了克隆测序. 根据鸡小肠Dmt1 3′RACE片段和5′RACE片段序列信息进行拼接,从而获得鸡小肠Dmt1 cDNA全序列信息.结果表明,鸡小肠Dmt1 cDNA有2种形式,1种全长为1 972个核苷酸,其中5′非翻译区为104个核苷酸,编码区1 695个核苷酸,3′非翻译区为173个核苷酸,编码1个含564个氨基酸残基的蛋白质;另1种形式为1 775个核苷酸,其中5′非翻译区为104个核苷酸,编码区1 593个核苷酸,3′非翻译区为78个核苷酸,编码1个含530个氨基酸残基的蛋白质.据鸡Dmt1 cDNA推测出的2种形式蛋白质的氨基酸序列与人、大鼠和小鼠的Dmt1蛋白具有高度同源性,它们的同源性分别为82%、82%、80%,和 84%、84%、83%. 对推测氨基酸序列进行疏水性和跨膜区分析表明,Dmt1蛋白为1种跨膜整合蛋白,具有膜转运蛋白糖基化位点和底物结合位点的保守序列.     

H1N1流感病毒聚合酶片段的CpG抑制及其对密码子偏爱性的影响

H1N1流感病毒的聚合酶具有RNA复制、转录等功能,并且对流感病毒片段包装、子代繁殖及宿主适应性等有着重要作用。通过分析人、猪及禽类H1N1流感病毒聚合酶片段的二核苷酸频率及同义密码子的偏爱性,发现不同宿主中,流感病毒聚合酶片段的CpG频率最低,且均被强烈抑制;通过三类宿主间的比较发现,人流感病毒抑制最为强烈,且其CpG频率随年份呈下降趋势,但2009年毒株的CpG频率突然上升。比较同义密码子使用频率发现,含有CpG的同义密码子相对使用频率均小于1,证明CpG抑制作用是影响同义密码子偏爱性的一个重要因素。以上结果暗示,CpG抑制对H1N1流感病毒的进化及跨宿主传播可能有重要影响。     

宫颈癌患者血浆和组织中FHIT基因5′端CpG岛甲基化状态的研究

为了检测宫颈癌患者血浆和组织中FHIT基因5′端CpG岛甲基化状态, 以找到无创伤性诊断宫颈癌的新指标, 选取151例宫颈癌患者的血浆和30例患者的宫颈癌组织为研究对象,用MSP的方法检测FHIT基因5′端CpG岛甲基化状态, 并对MSP产物进行克隆和测序。结果在宫颈癌患者血浆和组织中, FHIT基因5′端CpG岛甲基化率为30.46%和53.33%, 血浆和组织的总体符合率为80%。而对照中均未检测到甲基化状态。随着患者临床分期和组织学分级的增加, FHIT基因甲基化的检出率也在逐渐的增加。表明宫颈癌患者的血浆和肿瘤组织中FHIT基因5′端CpG岛甲基化的发生是高频事件, 使用FHIT基因作为标记可以对宫颈癌患者进行无创伤诊断和预后的评估。