血清7型胸膜肺炎放线杆菌apxⅡC-/apxⅠA+基因缺失重组菌株的构建与鉴定

通过接合转移和SacB负向筛选方法,成功构建了一株apxⅡC缺失的血清7型胸膜肺炎放线杆菌重组菌株。首先构建重组转移质粒pEHA1。将pEHA1转化供体菌大肠杆菌(E.coliβ2155),并将其与野生型APP血清7型亲本菌混合培养约5h,然后涂到含氯霉素抗性的培养基培养,挑取阳性克隆,接种到无抗性液体培养基,培养后涂于含有蔗糖的的固体培养基,培养一定时间后挑取蔗糖抗性的克隆,即可得到目的突变株。通过PCR、遗传稳定性、外毒素分泌、重组位点序列分析证明重组菌构建成功。通过对重组菌生物学特性进行初步研究,表明突变株生长能力未受影响,对小鼠毒力显著降低。该突变株构建体系的建立为猪传染性胸膜肺炎减毒活疫苗的开发及对胸膜肺炎放线杆菌新基因的功能研究奠定了良好基础。     

胸膜肺炎放线杆菌血清10型apxIC-/p36+弱毒株的构建与鉴定

摘要：【目的】构建血清10型胸膜肺炎放线杆菌弱毒菌株,为胸膜肺炎放线杆菌减毒活疫苗研究奠定基础。【方法】通过细菌接合转移和SacB负向筛选标记完成突变株的构建与筛选,用PCR、Western blot、重组位点序列对突变株进行鉴定分析。首先构建含肺炎支原体p36基因的pEICALDH重组转移质粒,并转化供体大肠杆菌( E. coliX7213),将转化的阳性克隆子与野生型APP血清10型亲本菌混合培养6 h;然后涂至含氯霉素抗性和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）的TSA培养基培养,挑取阳性克隆,接种至无抗性的含NAD的TSB液体培养基,培养6～8 h后涂至含10%的蔗糖及NAD的TSA培养基,培养24 h后挑取蔗糖抗性的克隆,即得到目的突变株。【结果】小鼠毒力试验结果表明突变株比亲本株的毒力显著降低;生长特性分析结果显示突变株与亲本株的增殖能力无显著差异;同时免疫试验结果表明突变株与安全剂量的亲本株均可诱导小鼠产生较好的免疫反应,证明apxIC基因缺失并不影响APP的免疫活性。【结论】成功构建了含猪肺炎支原体p36基因的胸膜肺炎放线杆菌血清10型突变株,所获得的突变株有望成为猪传染性胸膜肺炎弱毒疫苗株。     

猪传染性胸膜肺炎放线杆菌毒素apxH基因无药物抗性标记突变株HBC-/GFP+的构建及其生物学特性研究

通过使用枯草芽胞杆菌一个蔗糖敏感sacB基因发展了一种依靠蔗糖的负向筛选系统,这种方法允许没有标记突变的基因进入胸膜肺炎放线杆菌染色体。首先,构建了猪传染性胸膜肺炎放线杆菌毒素apxⅡ基因GFP插入失活型的重组质粒pOSAKCG,其中一个表达盒含有氨苄青霉素基因和以外膜蛋白omlA作为启动子表达sacB基因。重组质粒pOSAKCG通过电穿孔转化,它的突变apxⅡCA基因与野生型亲本菌株胸膜肺炎放线杆菌HB03染色体上野生型apxⅡCA基因发生同源交换,两步法筛选获得了apxⅡ基因突变株HBC^-／GFP^ ,PCR和Southern blot对突变株进行初步鉴定,进一步对突变株的一些生物学特性,包括它的溶血活性、免疫原性、生长特性及其对小鼠的安全性进行了研究。结果表明,无药物抗性标记突变株的构建是成功的。该突变株的构建为进一步研究突变株作为载体和疫苗奠定了坚实的基础。     

猪传染性胸膜肺炎放线杆菌毒素apxII基因无药物抗性标记突变株HBC-/GFP+的构建及其生物学特性研究

通过使用枯草芽胞杆菌一个蔗糖敏感sacB基因发展了一种依靠蔗糖的负向筛选系统 ,这种方法允许没有标记突变的基因进入胸膜肺炎放线杆菌染色体。首先 ,构建了猪传染性胸膜肺炎放线杆菌毒素apxII基因GFP插入失活型的重组质粒pOSAKCG ,其中一个表达盒含有氨苄青霉素基因和以外膜蛋白omlA作为启动子表达sacB基因。重组质粒pOSAKCG通过电穿孔转化 ,它的突变apxIICA基因与野生型亲本菌株胸膜肺炎放线杆菌HB03染色体上野生型apxIICA基因发生同源交换 ,两步法筛选获得了apxII基因突变株HBC^-GFP⁺,PCR和Southernblot对突变株进行初步鉴定 ,进一步对突变株的一些生物学特性 ,包括它的溶血活性、免疫原性、生长特性及其对小鼠的安全性进行了研究。结果表明 ,无药物抗性标记突变株的构建是成功的。该突变株的构建为进一步研究突变株作为载体和疫苗奠定了坚实的基础。     

构建胸膜肺炎放线杆菌apxIC基因插入突变株

目的：构建胸膜肺炎放线杆菌（APP）apxIC基因插入突变菌株,以鉴定ApxⅠ毒素的生物学特性。方法：根据apxⅠ核酸序列（U05042）设计1对引物,用于自APP血清10型参考菌株（D13039）基因组DNA中扩增apxIC基因及其上下游约2．8kb的基因片段,经克隆测序后在apxIC基因下游xbI酶切位点处插入约0．9kb的氯霉素（Chl）抗性基因表达盒,构建用于转化的转移载体pUIC-Chl^r,将转移载体DNA经电转化导入APP血清10型参考菌株中进行同源重组,以获得突变菌株。结果：在含有氯霉素的培养基中经筛选获得2株丧失溶血活性的突变菌株（D13039C-Chl^r）;利用PCR和Southern blot对突变菌株鉴定,显示氯霉素抗性基因已被插入细菌基因组中。结论：利用电转化和同源重组技术构建成功APP apxIC基因插入突变菌株,为分析ApxⅠ毒素的生物学特性,进而研制APP基因工程减毒活疫苗奠定了基础。     

猪胸膜肺炎放线杆菌溶血毒素的克隆表达及其对小鼠 免疫保护作用

将猪胸膜肺炎放线杆菌血清3型分离株的ApxⅡA、ApxⅢA、ApxⅣA基因和血清5型分离株的ApxⅠA基因分别克隆到原核表达载体pGEX-5x-3,并在大肠杆菌BL21中进行表达.SDS-PAGE结果表明重组菌表达的最佳条件为诱导时间2小时和IPTG终浓度1mmol/L.通过硫酸铵盐析和Sephadex G-200凝胶过滤层析纯化表达产物.Western blot检测结果显示表达产物具有免疫活性.按照不同组合将表达产物与弗氏佐剂等比例混合,制备3种亚单位疫苗.并在30日龄和45日龄免疫小白鼠,在60日龄分别用血清1、3、5、7和10型胸膜肺炎放线杆菌攻毒.血清1、5和7型胸膜肺炎放线杆菌攻毒后,3种亚单位疫苗分别提供58.4%、66.6%和91.7%的保护率.试验结果表明重组蛋白具有免疫保护作用,且含有四种融合蛋白的亚单位疫苗免疫保护效果最佳.     

表达ApxIA的血清7型胸膜肺炎放线杆菌弱毒菌株的构建及特性分析

猪传染性胸膜肺炎是由胸膜肺炎放线杆菌引起的一种高度接触传染疾病,严重阻碍着全球养猪业的发展,疫苗接种是控制该病的有效措施。为提高胸膜肺炎放线杆菌弱毒疫苗的免疫效力,以及探索胸膜肺炎放线杆菌弱毒疫苗作为呼吸系统病原疫苗载体的可行性,通过穿梭质粒pJFF224-XN将完整的apxIA基因导入apxIIC基因缺失突变株HB04C-中,构建了含有apxIA和apxIIA基因的弱毒疫苗菌株HB04C2(apxIIC-/apxIIA+/apxIA+)。通过对HB04C2的生物学特性分析发现,穿梭质粒可稳定传代,并表达ApxIA,其生长特性未受穿梭质粒的影响。将HB04C2以气管接种方式免疫仔猪,可产生针对ApxIA和ApxIIA的抗体。二免后2周以高致病性的血清1型胸膜肺炎放线杆菌攻毒,该弱毒疫苗可提供良好的免疫保护效果。     

肺炎克雷伯菌KP1＿4563基因突变株的构建及其生物膜表型分析

KP1_4563基因是肺炎克雷伯菌NTUH-K2044中假设的蛋白编码基因,与Ⅲ型菌毛的功能有关。本实验首先采用同源重组基因敲除方法构建肺炎克雷伯菌KP1_4563基因缺失的突变株(Kp-△4563),然后PCR扩增KP1_4563基因片段,克隆到质粒p BAD33上,将重组质粒导入Kp-△4563获得回补株(Kpc-△4563)。分别测定野生株、突变株、回补株用普通LB培养基,改良Minka培养基以及含胆汁盐的LB培养基培养时生物膜形成能力,以此来探讨KP1_4563基因以及不同培养基对肺炎克雷伯菌体外生物膜形成的影响。我们成功构建KP1_4563基因缺失的突变株和回补株Kpc-△4563。与野生株相比,突变株Kp-△4563生物膜形成能力减弱,回补株介于野生株和突变株之间。使用改良Minka培养基使菌株菌毛化以及加入胆汁盐可以增加生物膜的形成能力。这些分析表明肺炎克雷伯菌KP1_4563基因能正调控细菌生物膜的形成。体外培养使细菌菌毛化以及加入胆汁盐可以促进生物膜的形成。     

Pseudomonas plecoglossicida NyZ12基因无痕敲除方法的建立

旨在建立一种适合环己胺降解菌NyZ12基因无痕敲除的可靠方法。通过overlapping PCR技术将目的基因上下游同源臂融合并克隆到自杀载体pEX18km上,将重组质粒转化到大肠杆菌S17pir中,再通过接合转移到假单胞菌NyZ12菌株内,经pEX18km质粒上sacB基因的反向筛选得到突变株并通过PCR方法和测序鉴定。结果显示,成功构建了假单胞菌NyZ12菌株orf4637的基因突变株(NyZ12Δ4637)。通过自杀载体同源重组可以成功获得敲除的无痕突变株,且突变株基因组上没有任何抗性筛选标记残留,为环己胺降解菌NyZ12基因功能研究提供了可靠的基因敲除技术。     

胸膜肺炎放线杆菌萘啶酸抗性菌株的选育和信号标签突变株的构建

胸膜肺炎放线杆菌(APP)是重要的猪呼吸道病原菌,给世界养猪业造成严重的经济损失.信号标签突变(STM)技术是在宿主动物体内鉴定病原菌毒力因子的高通量方法.通过体外传代选育出APP血清1型和3型萘啶酸抗性菌株,再以萘啶酸抗性菌株为受体菌,以携带mini-Tn10的标签质粒(pLOF/TAG1-48)的E.coli CC118 λ pir或S17-1λpir为供体菌,在或不在E.coli DH5α(pRK2073)的辅助下,进行三亲本或两亲本接合,通过抗性筛选、PCR和Southern杂交鉴定转座突变株.结果表明:体外萘啶酸加压传代很容易选育出萘啶酸抗性APP菌株,该抗性的产生与DNA促旋酶A亚基基因gyrA的突变有关.在APP与E. coli接合实验中,两亲本接合比三亲本接合操作更简单,效率也较高;APP不同菌株在接合和转座效率上存在很大差异,血清1型菌株高于血清3型菌株,3型标准菌株高于地方分离株JL03-R.本研究为APP STM突变体库的构建与毒力基因的鉴定奠定了基础.     

胸膜肺炎放线杆菌毒素apxⅣA基因的克隆与表达及间接ELISA方法的建立

参照APP血清1型apxⅣA基因序列合成了一对特异性引物,从本实验室分离鉴定的胸膜肺炎放线杆菌(APP)血清2型中扩增了apxⅣA基因5'端2445bp的片段.将该片段克隆到原核表达载体pET-28b的T7启动子下游,与6×His Tag融合,再转化大肠杆菌BL21(DE3),在IPTG的诱导下表达大小约90kD的蛋白.表达产物以包涵体的形式存在,且能与APP标准阳性血清发生特异性反应.将包涵体变性和复性后包被酶标板建立了间接ELISA方法(ApxⅣA-ELISA),特异性良好.用ApxⅣA-ELISA检测猪胸膜肺炎三价(1、2和7型)灭活菌苗和基因工程类毒素菌苗免疫猪血清抗体均为阴性,而1、2、7型APP活菌感染动物的血清抗体均为阳性.实验证明,ApxⅣA-ELISA不仅可以用于检测所有血清型APP的抗体,而且还可以用于APP自然感染猪和灭活菌苗免疫猪的鉴别诊断.     

胸膜肺炎放线杆菌apxIC基因插入失活突变株构建及免疫原性分析

胸膜肺炎放线杆菌是引起猪传染性胸膜肺炎(APP)的呼吸道病原菌,其分泌的Apx毒素是最重要的毒力因子之一。为构建APP突变弱毒菌株,在apxIC基因下游XhoI酶切位点处插入氯霉素抗性基因(Chlr)制备转移载体,通过电转化导入APP血清10型参考菌株(D13039)进行同源重组,筛选获得apxIC基因插入突变菌株D13039C-Chlr。该突变菌株特性鉴定结果表明其溶血活性完全丧失,可正常增殖和分泌ApxI毒素,连续10次传代后基因组中插入的Chlr基因可稳定遗传,利用5个剂量(2×108CFU~2×106CFU)对每组3只小鼠腹腔攻毒结果显示突变菌株毒力较母源菌株降低至少100倍以上,将突变菌株作为弱毒活疫苗经滴鼻途径免疫仔猪后利用APP血清1型(4074)和血清10型(D13039)菌株攻毒进行免疫原性鉴定,结果显示血清1型攻毒后非免疫组4头仔猪全部死亡而免疫组4头中死亡2头,非免疫组肺损伤指数(34.4)显著高于免疫组(17.5),血清10型攻毒后非免疫组肺损伤指数(17.5)也高于免疫组(10.5),同时鼻拭子和肺组织样品的细菌重分离数及PCR检测阳性数非免疫组也明显高于免疫组,表明突变菌株作为弱毒活疫苗对仔猪具有一定的交叉免疫保护力。该突变菌株的构建为鉴定ApxI毒素活性及研制具有交叉保护活性的APP弱毒活疫苗奠定了基础。     

一株嗜盐细菌的16SrRNA基因序列分析

目的:从舟山深海海泥中获得了底泥样品,并从中提取到了一株嗜盐细菌.方法:通过用不同盐浓度的培养基培养,挑取单菌落,反复划线纯化,得到了嗜盐菌的单菌落,通过菌株基因组DNA的提取、菌株的抗性实验、质粒的提取、16SrRNA的PCR扩增及克隆、16SrRNA的全序列分析等手段.结果:得到该菌株的16SrRNA的基因序列.结论:该株嗜盐菌是一株新色盐杆菌.     

Gluconobacter oxydans NH-10中NAD+型阿拉伯糖醇脱氢酶基因敲除菌株的构建

氧化葡萄糖酸杆菌Gluconobacter oxydans NH-10能够转化D-阿拉伯糖醇,经木酮糖生成木糖醇,但该菌中存在的NAD+型D-阿拉伯糖醇脱氢酶可将中间产物D-木酮糖还原成D-阿拉伯糖醇,从而影响木糖醇的积累.利用同源重组基因敲除的方法构建G.oxydans NH-10 NAD+型D-阿拉伯糖醇脱氢酶( sArDH)基因敲除突变株.PCR结果显示:sArDH基因在1株重组菌中完全被卡那抗性基因替代,表明sArDH基因敲除突变体构建成功.生物学特性鉴定显示:突变菌在菌落形态,生长状态方面与原始菌无明显差异.静息细胞转化D-阿拉伯糖醇结果显示,突变株不存在还原D-木酮糖产D-阿拉伯糖醇的逆反应,终产物木糖醇的产量有所提高.     

炭疽芽胞杆菌mntA基因缺失突变株的构建及鉴定

目的:通过同源重组的方法敲除炭疽芽胞杆菌减毒AP422株的mntA基因,使菌株进一步减毒,用于构建新的疫苗候选株。方法:利用PCR方法扩增mntA基因上下游同源臂后与温敏质粒连接,构建打靶载体,并转化炭疽芽胞杆菌减毒AP422株;利用抗生素和温度2种选择压力实现同源重组,敲除目标基因mntA,然后利用Cre-LoxP系统去除抗性筛选标记,得到无抗性标记的缺失突变株,并利用PCR和Western印迹等方法对重组菌进行系统鉴定,最后分析突变株的生物学性状。结果:敲除了AP422株的mntA基因,获得了无抗性标记的缺失突变株,突变株的生存竞争能力比原始菌株明显减弱。结论:突变株获得了进一步减毒,可用于构建新的疫苗候选株。     

大肠杆菌和肺炎克雷伯氏菌的共培养研究

为研究大肠杆菌(Escherichia coli)和肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)混菌体系,构建了基于抗生素筛选的2株重组菌。将携带卡那霉素抗性基因的载体pET-28a转化到肺炎克雷伯氏菌中,获得重组菌K.pneumoniae(pET-28a);将携带氯霉素抗性基因cm的重组载体pET-cm(卡那霉素和氯霉素双抗性载体)转化到大肠杆菌中,获得重组菌E.coli(pET-cm),在卡那霉素抗性培养基中单独培养及混合培养上述两株重组菌。结果发现:单独培养条件下,E.coli与K.pneumoniae的相对菌体密度为57.87%;混合培养条件下,E.coli与K.pneumoniae的相对菌体密度为1.94%;E.coli和K.pneumoniae相对于各自单独培养的存活率分别为2.57%和76.60%。上述结果表明,K.pneumoniae为混菌体系的优势菌,可强烈抑制E.coli的生长。     

猪胸膜肺炎放线杆菌毒素ⅢA基因的克隆、序列分析及原核表达

因胸膜肺炎放线杆菌的致病性主要是由毒素决定的,故参照猪胸膜肺炎放线杆血清2型菌株的序列（GenBank L12145）设计了一对特异性引物,用PCR的方法扩增apxⅢA基因并得到了长3 466bp的片段,然后将其克隆到pMD18T中,经酶切鉴定和序列分析表明克隆是成功的;再将apxⅢA插入到原核表达载体pET28b后,转化BL21(DE3),在IPTG诱导下获得高效表达,经Western blotting检测证实表达产物有活性。以表达产物包被ELISA板,建立了特异、敏感的ELISA诊断方法。     

产脂肪酶重组枯草芽胞杆菌的发酵优化

笔者所在实验室前期筛选到1株产脂肪酶粘质沙雷氏菌,克隆其脂肪酶基因,构建重组枯草芽胞杆菌Bacillus subtilis 168/pMA5-lipA,成功实现了来源于粘质沙雷氏菌的脂肪酶基因在枯草芽胞杆菌中的表达。基于以上工作基础上,对B.subtilis 168/pMA5-lipA进行了摇瓶水平上的产酶发酵优化。首先通过单因素和正交试验确定了有利于产脂肪酶的最佳培养基成分,并对发酵条件进行了优化。结果表明:优化后的培养基组分为蔗糖35 g/L,玉米浆27.5 g/L,(NH4)2SO41.25 g/L,CaCl24 g/L,pH 7.0。在最优发酵培养基的条件下,37℃、160 r/min摇床培养33 h,每毫升发酵液中重组菌脂肪酶酶活可达98.6 U,是优化前的3倍。     

肺炎克雷伯氏菌VBNC状态转化突变株的筛选与特性研究

采用双亲本接合法对从文山湖富营养化水体中分离得到肺炎克雷伯氏菌进行Tn5转座子插入诱变,在含四环素和卡那霉素的LB培养基上获得接合子,利用饥饿冷冻高渗透压法对接合子进行细菌VBNC状态转化突变株的筛选和特性的研究。结果表明,带有卡那霉素基因的Tn5成功地插入到了肺炎克雷伯氏菌的染色体中,在双抗性培养基上获得约2.3×104 cell/mL的接合子,转座效率为6.58×10-4。对多个接合子和对照肺炎克雷伯氏菌的诱导、筛选及比较,发现KPQT-7是最快进入VBNC状态的突变株,该突变株在胁迫诱导9d后超过30%的细胞都进入了VBNC状态,而对照的肺炎克雷伯氏菌至少要在诱导21d后才大部分进入VBNC状态。在此基础上,对VBNC转化突变株KPQT-7作进一步的遗传学分析将会为细菌VBNC状态分子机理的研究奠定坚实的基础。     

嗜麦芽寡养单胞菌D2株smp基因缺失株的构建及鉴定

为深入研究smp基因的功能,需构建嗜麦芽寡养单胞菌D2株smp基因缺失株。首先,PCR扩增D2株smp基因上游、下游片段作为上下游同源臂,同时扩增获得氯霉素抗性(cat)基因,采用SOE-PCR方法将各片段连接,然后双酶切后克隆入自杀质粒pEX18Tc,构建获得重组自杀质粒pEX18Tc-Δsmp/cat,并转化入大肠埃希菌SM10λpir。通过接合将重组自杀质粒转入嗜麦芽寡养单胞菌D2野生株,经同源重组以cat基因替换野生株的smp基因,链霉素和氯霉素双抗培养基筛选接合子,15%蔗糖选择培养基筛选smp基因缺失株。PCR、酶切和测序验证重组自杀质粒pEX18Tc-Δsmp/cat构建正确,缺失株的分泌蛋白经12%SDS-PAGE证实嗜麦芽寡养单胞菌D2株smp基因缺失株失去表达SMP蛋白的能力。结果显示成功获得smp基因缺失的嗜麦芽寡养单胞菌D2株,为进一步研究其功能和胞外分泌途径奠定基础。