睾丸特异抗原C_2B细胞抗原决定簇的定位

免疫性不育病人的血清（ＩＰＳ）能１００％地抑制人体外受精．用该血清筛选人睾丸ｃＤＮＡ基因表达文库,发现了一种新的睾丸特异抗原（称作Ｃ２）．通过ＤＮＡ顺序研究,并与基因库中的有关同源性基因数据进行比较,证实Ｃ２是一个新的特异蛋白．Ｃ２基因仅与睾丸组织的ｍＲＮＡ杂交．该克隆在大肠杆菌中所表达的融合蛋白能够被３个不同的不育病人血清识别．利用嵌套缺失和Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹的方法研究其抗原决定簇定位,发现Ｂ细胞抗原决定簇在羧基端２９个氨基酸范围内．用ＧＣＧ软件分析该抗原的氨基酸的亲水性和疏水性以及其存在于蛋白表面的可能性,确定其中的１５个氨基酸为抗原决定簇所必需,并合成了多肽     

利用枯草杆菌制造乙型肝炎核心抗原和口蹄疫病抗原

枯草杆菌是一种非致病的G~ 细菌,它与大肠杆菌不同,不产生内毒索,并大量分泌几种胞外蛋白。在商业上广泛用于生产酶和抗菌素。日本一向用Bac.subtilis(natto)制造某种传统食品。因而基因工程科学家将合适病毒基因插入PBDa以后,用Bac.subtilis制造FMDV的主要抗     

枯草芽孢杆菌表面展示技术用于黏膜疫苗的研究进展

枯草杆菌全名枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis),因其优秀的益生特性及芽孢良好的抗逆性而备受研究者青睐,由于芽孢的特殊结构及独特的生理特性,是酶和免疫原等外源蛋白的理想锚定点。采用枯草杆菌进行芽孢表面展示被认为是表达高活性和高稳定性的外源蛋白的方法之一。本文主要对枯草杆菌芽孢表面展示抗原蛋白以生产黏膜疫苗的策略和应用前景进行综述。     

利用原核表达系统制备家蚕非典型嗅觉受体Orco抗原蛋白

【目的】探索建立一种有效制备昆虫非典型嗅觉受体Orco抗原的方法,为Orco蛋白组织定位及功能研究奠定基础。【方法】设计带有BamH I和Hind III酶切位点的引物,采用RT-PCR方法扩增家蚕Bombyx mori Orco第 4-5跨膜区之间的基因片段,将其与原核表达载体pET-28a(+)双酶切处理后进行连接,然后转化大肠杆菌Escherichia coli感受态细胞DH5α,重组质粒再转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株,用IPTG诱导表达,用SDS-PAGE检测诱导蛋白,用 HisTrap HP亲和层析对诱导表达的大量蛋白进行纯化。【结果】 在大肠杆菌原核表达系统中,用IPTG诱导获得了与预测蛋白大小相符的目的蛋白,经SDS-PAGE检测发现目的蛋白以包涵体形式表达,在变性条件下经HisTrap HP亲和层析获得大量可用于抗体制备的纯化蛋白。【结论】利用原核表达系统可获得制备家蚕Orco抗体的抗原蛋白。     

结核分枝杆菌的热休克蛋白及其抗原

<正>由病原性分枝杆菌引起的疾病,仍然是人类发病率和死亡率引起的主要原因,在发展中国家的死亡率中仅结核病就达7％。目前预防和控制分枝杆菌感染的研究,已转向包括病原菌与其哺乳类宿主细胞间相互关系的分子机理的阐明。根据结核杆菌和麻风杆菌一些重要蛋白抗原的序列分析,已知它们是热休克蛋白谱系中的成员,和大肠杆菌蛋白的Dnak、GroEL和GroES相关。本文分析了热休克对结核杆菌蛋白合成的作用,以期为阐明分枝杆菌分子遗传学与宿主-寄生间相互关系提供重要资料。     

SARS-CoV N蛋白抗原表位的筛选和鉴定

利用噬菌体展示的线性12肽库从马抗SARS-CoV IgG筛选SARS-CoV的抗原表位.经生物淘洗富集的噬菌体克隆被测序.获得两个共有序列DXXDP和TXTLL.它们分别与SARS-CoV N蛋白341-345和392-396位氨基酸序列高度同源.含共有序列的克隆在ELISA竞争抑制试验中与SARS-CoV N蛋白竞争结合马抗SARS-CoVIgG.将两个共有序列肽通过基因重组技术成功展示到大肠杆菌鞭毛,获得重组菌F1和F2.用重组菌F1和F2免疫接种试验Balb/c小鼠产生的血清均能与SARS-CoVN蛋白特异结合.说明DXXDP和TXTLL是SARS-CoVN蛋白的两个连续抗原表位.     

SARS-CoVN蛋白抗原表位的筛选和鉴定

利用噬菌体展示的线性12肽库从马抗SARS-CoVIgG筛选SARS-CoV的抗原表位。经生物淘洗富集的噬菌体克隆被测序。获得两个共有序列:DXXDP和TXTLL。它们分别与SARS-CoVN蛋白341-345和392-396位氨基酸序列高度同源。含共有序列的克隆在ELISA竞争抑制试验中与SARS-CoVN蛋白竞争结合马抗SARS-CoVIgG。将两个共有序列肽通过基因重组技术成功展示到大肠杆菌鞭毛,获得重组菌F1和F2。用重组菌F1和F2免疫接种试验Balb/c小鼠产生的血清均能与SARS-CoVN蛋白特异结合。说明DXXDP和TXTLL是SARS-CoVN蛋白的两个连续抗原表位。     

酶和发酵工程

枯草杆菌(Bacillus subtilis)2633能超量生产α-淀粉酶(比其亲本品系枯草杆菌6160约高3000倍)。采用枯草杆菌-大肠杆菌穿梭载体 PHY 300 PLK 将枯草杆菌2633的一个α-淀粉酶基因克隆到大肠杆菌中。当含有α-淀粉酶基因的重组质粒 PAM 26被导入枯草杆菌6160后,一个转换体大约可产生40000 U/毫升的α-淀粉酶,为枯草杆菌6160的4000倍。这表明2633的α-淀粉酶基因(淀     

大肠杆菌表达的乙型肝炎病毒核心抗原的某些理化特性

1979年Pasek等用大肠杆菌表达乙型肝炎病毒核心抗原(HBcAg)成功以来,国内外也有类似的报道,但对其理化特性的报道不多。为了更有效地保存和应用此抗原,本文研究了从表达HBcAg的大肠杆菌菌液中纯化抗原的方法,以及抗原的某些特性。 HBcAg是由pHBV-1的C基因与pTL载体重组后在大肠杆菌BMH71-18内表达的,     

乙肝病毒preS抗原决定簇与核心抗原的融合表达

将乙肝病毒表面抗原的ｐｒｅＳ抗原决定簇片段与核心抗原进行融合,分别构建了在核心抗原中间对应第７５～８３位氨基酸之间的融合及在核心抗原羧端对应第１５６位氨基酸处的融合,并在ｔａｃ启动子的控制下于大肠杆菌中表达。表达产物经ＥＬＩＳＡ检测和ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔｔｉｎｇ分析,表明融合蛋白均被表达,其单体分子量大小与推算值一致．电镜观察和ＣｓＣｌ密度梯度超离心测定都表明融合蛋白能形成颗粒,其密度略小于天然的ＨＢｃ颗粒。初步纯化的融合蛋白免疫Ｂａｌｂ／ｃ小鼠;能产生高滴度的抗－ｐｒｅＳ１抗体,表明ＰｒｅＳｌ（２１～４７）在核心抗原ｅｌｌｏｏｐ区的融合能大大提高其免疫原性．     

K88抗原基因的克隆与表达I．K88抗原工程菌的研制

由产肠毒素大肠杆菌引起的仔猪黄痢病是在世界各地广泛流行的一种仔猪急性腹泻病。已经表明K88伞毛抗原在这类致病菌定居在仔猪小肠上起着重要的作用。质粒Ptk82是从国内流行的仔猪黄痢病致病菌——肠杆菌青3菌株中分离出来的。它是一个分子量约为50×10‘道尔顿的非接台型质粒,并含有K88ac抗原基因的决定子。在电子显微镜下可以观察到带有Ptk82的大肠杆菌C₆₀₀的细胞表面存在有K88伞毛。此质粒DNA经限制性内切酶HindI酶解后,使DNA片段连接到同样经内切酶酶解过的的Pbr322 DNA上,得到了一株能产生K88抗原的转化子,经鉴定后,此重组质粒定名为Ptk63。Ptk63dna经Ec0R I都分酶解,然后重新连接起来,得到分子量较小但仍台K88基因的重组质粒Ptk90。免疫学分析的结果表明,带有重组质粒Ptk90的大肠杆菌C₆₀₀所产生的伞毛抗原的性质,与带有Ptk82质粒的大肠杆菌C₆₀₀菌株或大肠杆菌青3菌株所产生的伞毛是相同的,大肠杆菌C₆₀₀／pTK82和大肠杆菌C600／pTK90菌株都是不带肠毒素基因的菌株,初步试验表明用它们制成的菌苗可以有效地预防仔猪黄痢病的发生。     

乙肝前S2抗原决定簇串联体与核心抗原的基因融合与表达

乙肝前Ｓ２（ＨＢＶＰｒｅＳ２）肽段由５５个氨基酸组成,其Ｎ端肽段含Ｔｈ和Ｂ细胞抗原决定簇,为增强ＰｒｅＳ２的抗原性,本实验采用将化学合成的ＰｒｅＳ２ｅｐｉｔｏｐｅ（１２０－１４５）基因以串联方式与ＨＢｃＡｇ的基因进行了融合,融合基因在大肠杆菌中获得表达,并通过ＥＬＩＳＡ比较研究了融合蛋白中ＰｒｅＳ_２ｅｐｉｔｏｐｅ单体及串联体的抗原性差异。     

胡蜂抗原5的研究进展

胡蜂抗原 5 (Ag5 )是胡蜂毒液中的一种主要变应原 ,对胡蜂过敏病人有变态反应作用。它一般由约 2 0 4个氨基酸残基组成 ,分子量约为 2 3kDa。不同的抗原 5之间有抗原交叉反应活性 ,且活性大小不同。它的cDNA已被克隆 ,并以融合蛋白的形式在大肠杆菌中进行表达。但Ag5的生物功能至今还不清楚。由于Ag5有抗原交叉反应活性 ,因此可将其用于免疫治疗。此外 ,Ag5还可用于植物病虫害防治     

鼠疫菌V抗原基因在大肠杆菌中的克隆及表达

从鼠疫杆菌野毒株总DNA中利用PCR方法扩增出V抗原编码基因,将此基因克隆到大肠杆菌的表达质粒pET42b(+)中,经IPTG诱导后,在大肠杆菌BL21(DE3)细胞中成功地表达出鼠疫菌V抗原蛋白。目的蛋白表达量占菌体总蛋白的32.8%。     

PDGF受体结合域与乙肝病毒核心抗原的融合表达

化学合成血小板源性生长因子受体结合域１３肽基因,并与乙肝病毒核心抗原基因５′端融合,序列分析表明化学合成的１３肽基因及融合后基因的阅读框架正确．将融合基因亚克隆于ｔａｃ启动子控制的ｐＥＴ３ａ表达质粒中并于大肠杆菌中表达．表达产物经ＥＬＩＳＡ、ＷｅｓｔｒｅｎＢｌｏｔ鉴定表明,融合蛋白已被表达,其单位分子量与推算值一致．电镜观察证明所表达的融合蛋白能形成颗粒．     

特异性抗原融合蛋白结核病疫苗研究进展

结核病是一种严重危害人类健康的重大传染病,由于BCG预防效果不佳,研制新型结核病疫苗迫在眉睫。研究开发新型结核病疫苗应根据机体抗结核杆菌感染的免疫应答特点、结合BCG的不足来开展。新型结核病疫苗主要分为三类:重组BCG或重组结核菌;重组痘病毒或重组腺病毒载体疫苗;蛋白抗原亚单位或重组融合蛋白抗原亚单位疫苗。由于蛋白亚单位疫苗可以不受机体已被分枝杆菌刺激的影响,能特异性地诱导CD4+Th1细胞和CD8+细胞毒性T细胞活化,并且使用安全性好,而备受研究者的青睐。目前主要是以BCG或重组BCG初次免疫,然后选择亚单位疫苗加强免疫作为结核病疫苗序贯免疫策略。然而,单个蛋白制成亚单位疫苗,其免疫效果有限,因此将多个具有保护效果的抗原或多肽表达成融合蛋白,联合适当的佐剂,制成融合蛋白亚单位疫苗。目前,已有一些融合蛋白亚单位疫苗进入临床试验阶段,更多的融合蛋白正处于研究阶段。     

乙型肝炎病毒前S2抗原决定簇（HBVPreS2epitope）与乙型肝炎病毒核心抗原（HBcAg）的基因融合与表达

乙肝前Ｓ２（ＨＢＶＰｒｅＳ２）肽段由５５个氨基酸组成,其Ｎ端肽段含Ｔｈ和Ｂ细胞抗原决定簇。我们将化学合成的ＰｒｅＳ２ｅｐｉｔｏｐｅ（１２０－１４５）基因与ＨＢｃＡｇ基因不同位点进行融合,融合基因在大肠杆菌中获得表达,并对融合蛋白进行了纯化。经ＥＬＩＳＡ和Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ实验表明,融合蛋白具有ＰｒｅＳ２和ＨＢｃＡｇ两者的抗原性。此外,研究还表明,强启动子能使表达水平有一定提高。     

枯草杆菌－大肠杆菌多功能穿梭载体的构建

由枯草杆菌载体pUBllO和大肠杆菌载体pGEM3构建了两个新的多功能穿梭载体pBE2和pBE3,它们具有强启动子和多酶切位点区。这两个载体能在枯草杆菌和大肠杆菌中复制和表达,是比较理想的载体。     

工程大肠杆菌K99抗原蛋白的分离纯化及其特性的研究

本工作采用了快速、简便的方法从大量培养的基因工程菌E.coil 1548(pHK99)表面分离和纯化了K99抗原蛋白,纯化产物在SDS-PAGE上呈现-条蛋白带,该蛋白的分子量约为16500,PAS反应结果表明该蛋白为糖最白,等电聚焦证实该蛋白pI为9．5,用免疫学方法证实了该蛋白大量存在于细菌表面,并具有较好的热稳定性,文中还讨论了该蛋白在不同培养基中的表达。     

枯草杆菌中性蛋白酶基因在大肠杆菌中的表达

蛋白酶是枯草杆菌(Bacillus subtilis)产生的具有重要工业价值的水解酶。对蛋白酶基因的分离与高效率表达一直是基因工程研究领域的重要内容之一^[1-4]。蛋白酶基因的筛选可采用不同的方法,如“免疫法”、“DNA 杂交法”、“遗传互补法”等。大肠杆菌(Escherichia coli)是基因工程中最常用的宿主菌, 若能以E．Coli作为筛选蛋白酶基因的宿主苗,那么使用E．Coli的常规载体,便可直接获得完整的蛋白 酶基因。枯草杆菌的蛋白酶基因能否在大肠杆菌中表达．则是实现这一目标的关键。Koide等人^[5]报道过枯草杆菌的胞内丝氨酸蛋白酶基因在大肠杆菌中的表达。转化细胞在含有脱脂牛奶的平板上可产生十分微弱的水解圈。Ikeraara等人^[6]将Subtilisin E(枯草杆菌蛋白酶E)插人大肠杆菌的表达载体,具有活性的Subtilisin E便可分泌到大肠杆菌的细胞周质中。吴汝平撰文指出^[7]。克隆的枯草杆菌蛋白酶基因不能在大肠杆菌中表达。是因为大肠杆菌不能转录枯草杆菌的促使生长调节基因。Wang等人^[8]则认为,在大肠杆菌中观察不到野生型的中性蛋白酶基因E(nprE)的表达。是因为nprE的表达产物对大肠杆菌有致死作用．除去该基因上的核糖体结合位点,nprE便能在大肠杆菌中低水平表达,并能将表达产 物分泌至胞外。由上可知．枯草杆菌的蛋白酶基因能否在大肠杆菌中表达以及表达的位置仍然是一个众说纷纭的问题,这一问题也正是能否用大肠杆菌作为宿主菌筛选蛋白酶基因的关键。