酪氨酸对大鼠离体颗粒细胞孕酮、雌激素和cAMP生成的影响

本实验应用培养细胞悬浮液的方法,研究了酪氨酸对经 PMSG 处理的未成熟大鼠颗粒细胞孕酮、雌激素和 cAMP 生成的影响。给30天龄未成熟雌鼠皮下注射 PMSG 100单位/只48小时后,取出卵巢,分离出排卵前卵泡中的颗粒细胞,制成细胞悬浮液。按实验要求,在细胞悬浮液中加入(1)培养液空白,(2)hCG(101U),(3)酪氨酸(20μg)和(4)α-MT(20μg)。培养45分钟后,取出一部分样品用蛋白竞争结合法测各管 cAMP 含量。培养4小时后,用放射免疫分析法测各管孕酮和雌激素含量。结果表明,hCG 和酪氨酸均可促进颗粒细胞孕酮、雌激素和 cAMP 的生成,当两者共同作用时,孕酮、雌激素和 cAMP 的生成量进一步增加。α-MT 与酪氨酸的作用相同,在α-MT 与酪氨酸共同作用时,不但未阻断酪氨酸的作用,而且α-MT 本身也表现酪氨酸样的作用,使孕酮、雌激素和 cAMP 的生成量进一步增加。本实验结果提示,酪氨酸而非其衍生物,可促进大鼠离体排卵前卵泡的颗粒细胞生成孕酮和雌激素。酪氨酸的这一作用可能是通过 cAMP 完成的。     

卵巢甾体激素与卵泡刺激素合并使用可提高颗粒细胞纤溶酶原激活物产生

卵泡刺激素(FSH)能刺激未成熟大鼠离体培养颗粒细胞的纤溶酶原激活物(PA)的产生,并呈剂量一依从性增加;已证实 PA 对卵巢的排卵有作用。Ny 等(1984)进一步证明,刺激颗粒细胞分泌的是组织型-纤溶酶原激活物(tpA),而不是尿激酶型-纤溶酶原激活物(uPA)。卵巢甾体激素等与 FSH 合并使用后,能提高卵巢 FSH-依从性 PA 的产生。用雌二醇(E_2)或孕酮单独处理培养中的颗粒细胞时,对 PA 的产生无明显影响。已知雌激素对卵巢细胞的成熟和发育超重要作用,其中包括:对颗粒细胞的增殖,增加 FSH 对颗粒细胞 cAMP 的形成,提高卵巢芳香化酶的活性等。活体动物经二乙基己烯雌酚预处理后,给予生理学浓度范围的 E_2,能增强 FSH所诱发的 PA 产生。E_2与 FSH 合并处理时,E_2的刺激作用有一时间的依赖性,即须经72h 的作用。给孕     

转铁蛋白抑制大鼠卵泡颗粒细胞FSH受体的结合与维持

转铁蛋白能抑制大鼠卵泡颗粒细胞的分化,但其机理尚不清楚。本实验用已烯雌酚处理后分离的大鼠颗粒细胞,观察了转铁蛋白对FSH结合到颗粒细胞,以及在培养过程中对颗粒细胞FSH受体量维持的影响。结果表明,生理浓度范围的转铁蛋白部分地阻断了~(125)I-rFSH结合到颗粒细胞上;将转铁蛋白与FSH一起处理细胞,发现它能剂量依赖性地抑制FSH对颗粒细胞FSH受体的维持作用,并表现为孕酮及雌二醇的分泌减少。     

螯合细胞外钙离子对体外培养的大鼠卵巢颗粒细胞成熟的影响

在发现利用钙离子螯合剂EGTA螯合细胞外钙离子(Ca 2 )后,可以显著抑制促滤泡(激)素(FSH)刺激体外培养的颗粒细胞合成和分泌雌激素,并且该抑制作用呈剂量依赖性.假设该特异性反应是通过Ca2 影响细胞内腺苷酸环化酶(AC)发挥作用的,因为Ca 2 具有激活ACVIII的作用.通过RT-PCR和Northern印迹检测大鼠不同阶段卵巢组织中ACVIII的表达.结果表明,虽然Ca2 可以调控颗粒细胞类固醇激素的合成,但不同阶段的卵巢组织中均检测不到ACVIII的mRNA.实验间接提示了Ca2 促进颗粒细胞成熟的作用不是通过ACVIII发挥作用的,而可能是通过其他AC同工酶或其他Ca2 信号通路发挥作用.     

酪氨酸对hCG诱导兔离体卵泡蛋白质及RNA合成的影响

为了深入探讨酪氨酸抗hCG致孕酮生成作用的机制,本文利用~3H-亮氨酸和~3H-尿嘧啶掺和入兔离体卵泡的方法,观察了酪氨酸对蛋白质及RNA合成的影响。结果显示,酪氨酸对hCG诱导的蛋白质、RNA合成具有明显的抑制作用,但同剂量的多巴胺或苯丙氨酸却无效。酪氨酸还抑制cAMP的生成,并可拮抗外源cAMP诱导蛋白质及RNA的合成。上述结果表明,酪氨酸可通过使cAMP生成减少和进入细胞内直接发挥作用两种方式抑制hCG诱导的兔卵泡蛋白质及RNA的合成。酪氨酸的这一作用可能与其抑制孕酮生成有密切的关系。     

窦前期卵泡颗粒细胞端粒酶的表达及调控

目的：观察体外培养的大鼠窦前期卵泡颗粒细胞中端粒酶表达的调控因素。方法：体外培养大鼠窦前期卵泡颗粒细胞,加入不同处理因素振荡培养,用端粒酶重复扩增酶联免疫吸附分析法（TRAP-ELISA法）分析端粒酶活性的改变。结果：在卵泡颗粒细胞中表达有端粒酶活性,且在人绒毛膜促性腺激素（hcG）、促卵泡生成素（FSH）、二丁酰环磷腺苷（dbcAMP）及维拉帕米（verapamil）作用下活性明显升高,而在反义c-myb作用下活性明显降低。同时用放射免疫法测定培养液中雌孕激素含量发现,在Verapamil及FSH作用下雌孕激素分泌量明显升高,在db-cAMP及hcG作用下分泌量无明显改变,而在反义c-myb作用下分泌量明显降低,在不同作用因素下的端粒酶活性与它相对应的E2分泌量成正相关r=0.953,P〈0.01。用四甲基偶氮唑盐（MTT）法测定,反义hTERT能明显抑制颗粒细胞的增殖。结论：窦前期卵巢的颗粒细胞中表达有端粒酶活性,强弱可进行调控。     

酪氨酸对大鼠离体Leydig细胞睾酮和cAMP生成的影响

本实验采用胶原酶消化,Ficoll 密度梯度离心,制备大鼠睾丸 Leydig 细胞悬浮液进行体外培养(每管内含有10~6 细胞),以研究酪氨酸对 Leydig 细胞睾酮和cAMP 生成的影响。实验结果表明,hCG(100mIU)能明显地促进Leydig 细胞睾酮和 cAMP的生成。睾酮从对照组的3.08±0.58ng(X±SD,下同)增加到41.61±1.52ng,cAMP 含量从19.62±2.56pmol增加到153.24±5.92pmol。若将酪氨酸(60μg)与hCG同时加入到细胞培养液中,则睾酮和cAMP 含量分别下降到 19.22±.0.52ng(P<0.01)和92.63±6.02pmol(P<0.05)。但是,酪氨酸羟化酶抑制剂(α-甲基酪氨酸)对酪氨酸抗hCG致睾酮生成作用无阻断效应,而酪氨酸对外源cAMP(2.5mM)诱导的睾酮生成,则有明显的抑制作用,睾酮含量从27.56±1.53ng降至 19.50±0.47ng(P<0.01)。以上实验结果表明,酪氨酸抗hCG致睾酮生成的作用机理与cAMP有关。     

c-erbB_2对大鼠黄体细胞hCG诱导的孕酮分泌的影响

采用离体细胞体外孵育法 ,研究反义c erbB2 寡脱氧核苷酸 (antisensec erbB2 ODN)对大鼠黄体细胞hCG诱导的孕酮分泌的影响 ,及其与外源性cAMP和Ca2 以及蛋白抑制剂放线菌酮 (CYX)之间的关系。结果表明 ,反义c erbB2 以剂量相关方式抑制黄体细胞hCG诱导的孕酮的产生 ,同时使c erbB2 蛋白染色阳性的黄体细胞百分数下降 ,无义tatODN没有相应的作用。10 -4 mol/L的二丁酰cAMP能明显反转反义c erbB2 ODN对孕酮产生和c erbB2 表达的抑制作用 ,钙离子通道阻断剂维拉帕米和蛋白抑制剂CYX对此抑制作用有协同效应。该实验说明c erbB2 参于hCG诱导黄体细胞生孕酮作用     

FSH诱导卵丘细胞分泌一种促减数分裂物质

本实验利用卵母细胞的体外培养模型,将小鼠卵丘－卵母细胞复合体（CEO）和去卵丘卵母细胞（DO）在体外培养,系统研究了促性腺激素（FSH、hCG）诱导小鼠卵母细胞减数分裂的机制。结果显示,FSH能剂量依赖性地诱导CEO恢复减数分裂（Fig.1),但对DO无影响;hCG对CEO、DO皆无效果（Fig.2);用FSH预处理CEO时间达到1小时后,就能显著诱导卵母细胞成熟,2小时后作用达到最大,不再增强（Fig.3);用FSH处理CEO2小时及24小时的培养液,能诱导DO恢复减数分裂,但预处理卵丘细胞24小时的培养液,并不能诱导DO恢复减数分裂（Fig.4A);这种培养液在70℃下30分钟后,仍能刺激DO成熟（Fig.4B);甾醇类物质合成抑制剂酮康唑,可剂量依赖性地抑制FSH的促减数分裂恢复作用（Fig.5)。这些结果说明,FSH可能诱导卵丘－卵母细胞复合体中的卵丘细胞分泌一种促减数分裂恢复物质;该物质用于卵母细胞,诱导其恢复减数分裂而成熟;这种物质可能是一种甾醇类物质。     

抑制素α基因表达下调对鹅卵泡颗粒细胞凋亡和增殖的影响

抑制素α基因是控制家禽排卵率的一个重要候选基因。为研究抑制素α基因对体外培养的鹅卵泡颗粒细胞增殖凋亡的遗传作用,构建psiRNA-INHα1和psiRNA-INHα2两个抑制素α基因干扰载体,以降低抑制素α基因表达。体外培养鹅F1和闭锁卵泡的颗粒细胞,经抑制素α基因干扰48h后,荧光显微镜检测转染效率,同时用流式细胞术检测抑制素α基因表达水平,以及细胞生长周期、细胞凋亡指数和增殖指数的变化,用放免法测定细胞培养上清中雌激素和孕酮水平。结果表明,抑制素α基因干扰后卵泡颗粒细胞抑制素表达水平比对照组降低30%～40%（P〈0.05）;细胞凋亡指数和增值指数显著高于对照组（P〈0.05）;细胞分泌雌激素水平显著下降（P〈0.05）。由此推断,抑制素α基因对颗粒细胞具有显著的抗凋亡效应。     

氯化锂对KT-1/A3细胞增殖和凋亡的影响

目的：研究氯化锂(LiCl)在体外对KT—1／A3白血病细胞增殖及凋亡的影响。方法：采用液体培养实验,MTT实验,集落培养实验为指标观察LiCl对KT—1／A3细胞增殖的影响,采用DNA片段凝胶电泳及流式细胞检测为指标检测细胞凋亡。结果：①不同浓度的LiCl(5mM—25mM)对KT—1／A3细胞具有抑制增殖的作用,这种增殖抑制作用呈剂量依赖关系。②在LiCl(20mM)作用72h的DNA凝胶电泳谱可见DNA Ladder及流式细胞仪检测可见凋亡特有的AP峰,提示LiCl可诱导KT—1／A3细胞凋亡。绪论：LiCl能抑制KT—1／A3白血病细胞增殖和诱导凋亡。     

白细胞介素-1抑制猪离体培养颗粒细胞的黄体化

白细胞介素-1(IL-1)具有广泛的生物学功能,它作为免疫介导剂而发挥重要作用。有人曾报道,腹腔巨噬细胞含有能促进小鼠黄体化颗粒细胞生成孕酮(P)的物质。因为 IL-1主要由活化的巨噬细胞生成,因而考虑 IL-1能否调控颗粒细胞的甾体生成功能。实验选用取自中等大小猪卵泡的颗粒细胞,在黄体生成素(LH)存在或不存在的条件下,与 IL-1共同培养,观察 IL-1对颗粒细胞 P 生成的影响。结果表明,IL-1显著抑制 LH 所促进的 P 生成,作用强弱取决于剂量大小。LH 所诱发的颗粒细胞黄体化形态变化也被 IL-1所     

不同培养时间对鸡卵泡颗粒细胞孕酮、雌激素分泌水平及FSHR、LHR基因表达的影响

目的：研究培养不同时间鸡卵泡颗粒细胞孕酮和雌激素的分泌水平,促卵泡素受体（FSHR）和促黄体素受体（LHR）的基因表达水平,推断体外培养时间对颗粒细胞激素分泌及相关受体基因表达的影响。方法：通过细胞体外培养的方法,分别于0 h、24 h、48 h、72 h、96 h收集鸡卵泡颗粒细胞上清液,采用ELISA法测定细胞上清液内的孕酮及雌激素分泌水平,并采用荧光定量PCR技术检测颗粒细胞内FSHR和LHR基因表达情况。结果：在培养初期0 h~48 h孕酮和雌激素分泌量显著降低（P < 0.05）,随着培养时间增加到72 h两种激素的分泌量又开始增加,并达到培养初期水平,培养至96 h细胞内孕酮和雌激素分泌量再次降低;颗粒细胞FSHR和LHR mRNA的表达水平则随着培养时间的增加而降低（P < 0.05）。结论：体外培养的卵泡颗粒细胞内孕酮和雌激素的分泌量随体外培养时间的延长呈先降低后升高的趋势,可能与体外培养细胞的生长状态相关,从整体上看随着培养时间的延长,细胞内孕酮和雌激素的分泌量均降低,可能与两种促性腺激素受体FSHR和LHR基因表达量下降相关。     

FSH,EGF,胰岛素促进小鼠卵母细胞体外减数分裂恢复机制的研究

FSH、EGF和胰岛素均对体外培养的小鼠卵母细胞的减数分裂的恢复起促进作用,而FSH的促进作用滞后,但作用后使卵丘细胞扩散。三者的促进作用似受卵巢颗粒细胞内游离钙和cAMP的调节。EGF和胰岛素可使培养的颗粒细胞内的cAMP水平降低;同时FSH使单个卵丘细胞内的游离Ca~(2 )水平降低,而胰岛素无影响。所以FSH、EGF和胰岛素诱发卵母细胞成熟的机制不同:EGF通过细胞内Ca~(2 )的升高和cAMP水平的下降促使卵母细胞的减数分裂恢复;FSH降低卵丘细胞内Ca~(2 )的水平,但由于卵丘细胞与卵母细胞之间的联系被打断,最终使GVBD发生;而胰岛素的作用只涉及胞内cAMP的变化。     

褪黑素抑制LPS诱导的脂肪细胞炎症反应及机制

研究褪黑素对脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)诱导的3T3-L1脂肪细胞炎症反应的抑制作用及机制。体外培养3T3-L1前脂肪细胞并诱导成为成熟的脂肪细胞,用不同浓度的褪黑素(50、100、200μmol/L)处理2 h后,加入LPS(2μg/m L)诱导炎症反应,于LPS处理后不同时间,取细胞,qRT-PCR测定肿瘤坏死因子α(Tumor Necrosis Factor Alpha,TNF-α)和白介素6(Interleukin-6,IL-6)的表达情况,Western blot法测定各组总蛋白p-IκBα的表达情况。取上清液,酶联免疫吸附法(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测TNF-α和IL-6的分泌情况。结果显示褪黑素显著抑制LPS诱导的3T3-L1脂肪细胞TNF-α和IL-6表达和分泌(P0.05),呈现剂量效果依赖性;Western blot结果表明褪黑素显著抑制LPS诱导的脂肪细胞IκBα磷酸化(P0.05)。这表明褪黑素通过降低LPS诱导的脂肪细胞IκBα磷酸化信号通路抑制脂肪细胞炎症反应。     

前列腺素E_2、F_(2α)对大鼠颗粒细胞PA活力的影响

年龄26—27天的Wistar雌鼠用PMSG与HCG诱导成熟,同时分别注射3、6、9 mg消炎痛,分离卵巢颗粒细胞并离体培养,培液中的PA活力经~(125)Ⅰ-纤维蛋白降解法检测,均无被抑制现象(图1)。仅用PMSG激动大鼠的颗粒细胞离体培养于含HCG及不同浓度(10~(-8)mol/L—10~(-5)mol/L)的消炎痛培液内,各组PA活力均未出现明显变化(图2)。离体条件下PGE_2增强PMSG激动大鼠颗粒细胞PA活力的事实说明,消炎痛抑制实验未能显示前列腺素与PA的关系,可能因所用以诱导大鼠临近排卵的PMSG和HCG分别所含FSH与LH的高活力促使PA活力达到最高点,以致前列腺素对PA的影响被掩盖;PGF_(2α)对PA未显示任何作用(图4)。另外,PGE_2使仅接受PMSG大鼠颗粒细胞PA升高的事实(图3)提示,PGE_2有摹拟LH的作用;未经PMSG与HCG处理鼠的卵泡细胞的PA活力也受PGE_2的影响,说明它还有摹拟FSH的作用。     

卵母细胞第一次减数分裂的阻滞和恢复

哺乳动物卵母细胞第一次减数分裂阻滞期间,来自卵母细胞的Gs-GPR-ADCY诱导环磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate, cAMP)的生成,升高卵母细胞内cAMP的水平。颗粒细胞中的C型利钠肽(natriuretic peptides C, NPPC)和肌苷-5'-磷酸脱氢酶(inosine-5′-monophosphate dehydrogenase, IMPDH)调节卵丘颗粒细胞中环磷酸鸟苷(cyclic guanosinc monophosphate, cGMP)的生成,cGMP进入卵母细胞抑制cAMP-磷酸二酯酶(cAMP-phosphodiesterase, cAMP-PDE)活性,升高cAMP浓度,并使细胞质成熟促进因子(maturation promoting factor, MPF)处于非活化态,最终诱导了减数分裂阻滞在双线期。促黄体素(luteinizing hormone, LH)峰的出现一方面降低了壁颗粒细胞中NPPC的水平,另一方面激活了卵丘颗粒细胞丝裂原活化蛋白激酶3/1 (mitogen-activated protein kinase3/1, MAPK3/1),两者均降低了卵母细胞中cGMP的浓度,促进cAMP水解,使得MPF处于活化态,最终诱导了减数分裂恢复。该综述将探讨这两种环核苷酸如何通过阻断或启动减数分裂过程来调节卵母细胞成熟,并对未来的研究提供一定的见解。     

c-fos、c-myb和c-erbB-2与大鼠卵巢颗粒细胞生孕酮调控关系的研究

目的和方法:用离体细胞体外孵育法,观察反义c-fos、c-myb和c-erbB-2 寡脱氧核苷酸(c-fos ODN、c-myb ODN和c-erbB-2 ODN)对hCG诱导大鼠颗粒细胞孕酮产生的影响,同时观察内皮素-1、γ-氨基丁酸和钙离子通道阻断剂维拉帕米对颗粒细胞中c -fos、c-myb和c-erbB-2蛋白的影响.结果:反义c-fos、c-myb和c-erbB -2 ODN均明显抑制hCG诱导颗粒细胞孕酮的产生,并伴有各自癌基因蛋白染色阳性的颗粒细胞百分率下降;而无义tat ODN没有相应的作用.2×10-7mol/L内皮素-1和5×10 -6mol/L γ-氨基丁酸能显著抑制hCG诱导颗粒细胞孕酮的产生,同时使c-fos、c-my b和c-erbB-2蛋白染色阳性的颗粒细胞百分率下降;而1×10-6mol/L维拉帕米对hCG 诱导颗粒细胞孕酮的产生和c-fos、c-myb和c-erbB-2蛋白染色阳性的颗粒细胞百分率均无明显影响.结论:c-fos、c-myb和c-erbB-2与hCG诱导颗粒细胞孕酮的产生密切相关;内皮素-1、γ-氢基丁酸能通过调节这些癌基因在颗粒细胞中的表达而影响hCG诱导颗粒细胞孕酮的产生;而Ca2+无相应的作用.     

促卵泡激素结合片段通过P13K／Akt—cyclinD1通路抑制卵巢癌细胞增殖活性

目的：研究促卵泡激素（FSH）结合片段对卵巢上皮性细胞癌细胞株hey增殖活性的影响。方法：应用卵巢上皮性细胞癌细胞株hey作为实验对象,分别加入FSH、FSH结合片段、FSH＋FSH结合片段。用四甲基偶氮唑蓝（MTT）法检测卵巢癌hey细胞的生长状况,Westernblot检测cyclinD1、Akt、pAkt分子的表达。结果：FSH对卵巢癌hey细胞的生长有明显的促进作用,细胞生长活性提高21％。FSH结合片段对卵巢癌细胞的生长有明显抑制作用,对细胞平均抑制率为22％,且能下调cyclinD1的表达,在2．5×10^-9Mol／L达70％。FSH结合片段对FSH有竞争抑制作用,细胞抑制率为18％,能抑制FSH上调cyclinD1的作用,抑制率为61％。FSH能上调pAkt的表达,对Akt的袁达没有明显影响,在40mlU／ml的浓度时pAkt／Akt上调率达224％。FSH结合片段对Akt的表达没有明显影响,但能明显下调pAkt的表达,且呈时间依赖性（在15分钟时达66％）和剂量依赖性（在2．5×10^-9Mol／L达31％）。FSH结合片段能抑制FSH上调pAkt的作用,抑制率为80％。结论：FSH结合片段可通过抑制FSH诱导的P13FdAkt-cycl—inD1信号通路进而抑制上皮性卵巢癌hey细胞的增殖活性,     

生长激素和胰岛素样生长因子-Ⅰ加速孕马血清促性腺激素诱发的颗粒细胞分化

曾报道,生长激素(GH)、胰岛素和胰岛素样生长因子-I(IGF-I)能调节颗粒细胞成熟,但其作用机理尚未充分阐明。Hutchinson 等研究了 GH、IGF-I 和卵泡刺激素(FSH)间相互作用的性质,以及它们对颗粒细胞甾体生成作用的影响。实验所用颗粒细胞取自己烯雌酚处理的未成熟大鼠,在离体条件下再用孕马血清促性腺激素(PMSG)或 FSH 加以刺激。结果表明,GH 在 PMSG 存在下,能增加芳香化酶活性和孕酮