幽门螺杆菌疫苗研究进展

幽门螺杆菌由于在人群中具有较高的感染率及被WHO确认为Ⅰ类致癌因子而受到重视,近年来对它的疫苗研究进展迅速,本文对幽门螺杆菌的全菌体疫苗,亚单位疫苗,重组减毒疫苗,微球疫苗及临床实验的情况进行了综述。     

幽门螺杆菌感染引起的免疫应答及其对疫苗研制的启示

幽门螺杆菌是一种全世界范围的人类感染病原菌,人感染该菌后可以被诱导产生较强的体液免疫应答和一定程度的细胞免疫应答反应;但是,自然感染往往不能使机体产生有效的免疫保护,相反可引起对机体的免疫病理损伤,有效的疫苗应该被设计为能够诱导机体产生非病理损伤的特异的免疫保护反应,以此来预防和治疗幽门螺杆菌相关性疾病。本综述了这些方面的研究进展。     

幽门螺杆菌UreB和HspA DNA疫苗的构建及免疫评价

本研究选择幽门螺杆菌尿素酶B和热休克蛋白A为候选抗原,通过PCR扩增基因,克隆至真核表达质粒pCD-NA3.1(-)His-Myc上,构建成DNA疫苗,通过小鼠免疫效果的评价,获得两株具有免疫源性DNA疫苗。     

幽门螺杆菌尿素酶B亚单位基因工程菌发酵工艺的研究

通过不同培养基、不同葡萄糖浓度、不同溶氧条件、补料与非补料对幽门螺杆菌尿素酶B亚单位(UreB)基因工程菌的菌体生长与外源蛋白表达量的影响的比较 ,建立了稳定、适宜的幽门螺杆菌尿素酶B亚单位基因工程菌发酵工艺。多批实验结果证明 ,菌体单产可达 86 g/L ,目的蛋白的表达率为 38.2 %。     

幽门螺杆菌HspA融合蛋白口服疫苗的构建

构建表达幽门螺杆菌的保护性抗原分热休克蛋白A亚单位(HspA）和霍乱毒素B亚单位（CtxB）的重组融合蛋白的生物工程菌株,以此制备幽门螺杆菌的口服疫苗。用PCR方法扩增hspA和ctxB两个目的的基因片段,将它们分别克隆至pSK（＋）质粒上,然后插入含T7启动子ET－22b（＋）的表达载体中,构建嗓基因的表达质量pET－hct,转化E.coliBL21(DE3）,经IPTG诱导表达融合蛋白HCT。经测序,hspA-ctxB(hct)融合基因片段由726bp组成,可以编码242个氨基酸残基的多肽。经SDS－PAGE和免疫印迹分析检测发现,融合基因表达的蛋白质相对分子质量约为30kD。融合蛋白经镍离子柱纯化、复性后,和HspA共同标记同位素^125I,然后给小鼠灌胃,结果观察到HCT组小鼠血清中的^125I的放射量要明显高于HspA组（P＜0．001）,且吸收峰值时间明显提前。融合蛋白中的CtxB可明显促进小鼠对HspA的吸收,HCT融合蛋白可以作为预防和治疗幽门螺杆菌感染的侯选口服疫苗。     

幽门螺杆菌疫苗的研究现状

幽门螺杆菌（ＨＨ）是慢性胃炎和消化性溃疡的主要病因,并与胃癌的发生密切相关,其相关致病因子主要包括尿素酶、细胞粘附素、过氧化氢酶、脂酶、蛋白酶、细菌毒素和能导致炎症反应的物质。ＨＰ的致病机理与ＨＰ的致病性和宿主免疫应答有关,尤以细菌的毒性占主导地位。近年来国内外均关注ＨＰ的免疫预防和治疗。由于ＨＰ减毒活疫苗的研究条件尚不成熟,目前正重点进行全菌体死疫苗、组分疫苗及基因工程疫苗的研究,ＨＰ动物模型、疫苗的免疫途径、免疫佐剂的研究已取得了令人满意的进展,ＨＰ疫苗的治疗作用更引起了人们的关注。本文对ＨＰ的致病机理、疫苗的研究进展等做一综述。     

幽门螺杆菌疫苗诱导的免疫保护反应及临床试验研究进展

幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)是一种微需氧、寄生于胃黏膜表面的革兰阴性致病菌,可导致各种不同的疾病,如慢性活动性胃炎、胃和十二指肠溃疡,甚至包括胃黏膜相关淋巴样组织(mucosa-associated lymphoid tissue,MALT)淋巴瘤和胃腺癌等恶性疾病。目前根除Hp主要依靠包括2种抗生素、铋剂和质子泵抑制剂(proton pumpinhibitors,PPI)在内的四联疗法。随着Hp耐药性的增强,研发Hp疫苗成为防治Hp感染的新途径。Hp疫苗能够诱导机体产生抗原特异性血清IgG和黏膜sIgA体液免疫反应以及抗原特异性CD4+T细胞免疫反应等的有效免疫保护反应。     

幽门螺杆菌感染免疫逃逸机制的研究

研制有效的幽门螺杆菌疫苗,是防治该菌感染的有效途径。本文综述幽门螺杆菌感染的免疫逃逸机制的研究进展,以便深入了解幽门螺杆菌慢性感染的机制,为研制疫苗提供新的思路。     

幽门螺杆菌表面抗原免疫保护作用的体外与活体研究

目的：调查幽门螺杆菌（Hp)几种表面蛋白体外对T细胞增殖的影响和在小鼠体内的免疫保护作用。方法：评价Hp全菌抗原、尿原酶（Urease)、黏附素（hpaA)、外膜蛋白25（Hop25)和38（Hop38)对人外周血T细胞及小鼠CD4^ T细胞增殖的影响;与佐剂合用,评价上述重组蛋白对小鼠Hp感染的免疫预防作用。结果：Urease和Hop25可刺激人及鼠T细胞增殖,hapA只能刺激Hp^ PBL增殖,而Hop38则有毒性作用;Hop25和Hop38均可产生60％的完全保护,hpaA可产生100％的部分保护即降低细菌定植密度,而Urease只能产生40％的部分保护。结论：外膜蛋白可能是一组高效的Hp疫苗免疫原;其长期免疫效果及对T细胞功能的活体调节作用尚需进一步评价。国际上尚未见相关报道。     

幽门螺杆菌多价表位疫苗CWAE的表达及其免疫学性质的研究 *

目的 利用生物信息学软件评价幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)多价表位疫苗CWAE的抗原结构,经原核表达获得高纯度CWAE蛋白,进而鉴定多价表位疫苗CWAE的免疫学性质。方法 通过生物信息学软件分析H. pylori多价表位疫苗CWAE的抗原结构;用人工合成的H. pylori多价表位肽融合基因WAE替换重组质粒pET28a-CUE中的UE基因,构建重组质粒pET28a-CWAE。然后,将pET28a-CWAE转入大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导表达,并通过Ni-NTP镍离子亲和层析纯化抗原蛋白CWAE;利用GM1-ELISA鉴定CWAE中CTB组分的黏膜免疫佐剂活性。最后,通过ELISA和小鼠脾脏淋巴细胞增殖实验检测CWAE激发BALB/c小鼠产生抗H. pylori抗体体液免疫和淋巴细胞免疫应答的能力。结果 通过生物信息学软件证实H. pylori多价表位疫苗CWAE具有科学合理的结构;重组表达质粒pET28a-CWAE经PCR、双酶切和基因测序鉴定,融合基因CWAE与设计序列完全一致;重组基因工程菌株pET28a-CWAE/BL21(DE3)经IPTG诱导表达,抗原蛋白CWAE主要以包涵体形式存在,经Ni-NTP镍离子亲和层析纯化,纯度约达93.2%;GM1-ELISA实验证实,CWAE中CTB组分依旧保持有较好的黏膜佐剂活性;ELISA结果证实CWAE能够激发BALB/c小鼠产生H. pylori特异性抗体,而小鼠脾脏淋巴细胞增殖实验进一步证实CWAE能够激发针对H. pylori多种致病因子的淋巴细胞免疫反应。结论 H. pylori多价表位疫苗CWAE具有科学合理的抗原结构,经原核表达可获得高纯度抗原蛋白,能够激发BALB/c小鼠产生H. pylori特异性抗体体液免疫和淋巴细胞免疫应答。为研发防治H. pylori感染的多价表位疫苗奠定实验基础。     

利用展示尿素酶B表位的大肠杆菌菌蜕递送幽门螺杆菌核酸疫苗

探讨和分析了重组大肠杆菌菌蜕递送系统能否进一步提高幽门螺杆菌核酸疫苗的免疫应答水平.首先构建了展示尿素酶B表位的重组大肠杆菌菌蜕,然后以此菌蜕包裹幽门螺杆菌核酸疫苗pcDNAKAT,经DNA凝胶电泳、荧光显微镜观察和FACS分析,表明该质粒DNA可以非特异地结合到大肠杆菌菌蜕内膜上.该核酸疫苗经重组菌蜕包裹后免疫小鼠,其血清抗过氧化氢酶抗体效价由单独免疫时的1∶(307±39)提高到1∶(520±54),二者差异极显著(P=0.005 8),结果表明利用菌蜕递送系统能较好地提高核酸疫苗的免疫应答水平.     

益生菌辅助四联疗法对H. pylori感染患者根治效果及肠道菌群的影响

研究益生菌辅助四联疗法对H. pylori感染患者根治效果及肠道菌群的影响。

选择2019年1月至2020年6月在我院接受治疗的160例H. pylori感染患者为研究对象,用随机数字表法分为对照组（n = 80）和观察组（n = 80）。对照组患者给予标准铋剂四联药物治疗,观察组加用双歧杆菌四联活菌片治疗。比较两组患者的H. pylori根除率、复发率、不良反应发生率、临床症状（上腹痛、上腹胀、嗳气、纳差）、肠道菌群（双歧杆菌、乳杆菌）和炎性因子[白细胞介素-6（IL-6）、白细胞介素-8（IL-8）及肿瘤坏死因子-α（TNF-α）]水平。

观察组患者的H. pylori根除率（95.00%）高于对照组（82.5%）,复发率和不良反应发生率低于对照组（均P＜0.05）。治疗后两组患者的临床症状积分均显著下降,同时观察组患者上腹痛、上腹胀、嗳气、纳差等临床症状积分低于对照组（均P＜0.05）。治疗后观察组患者肠道双歧杆菌和乳杆菌数量升高,而对照组降低,同时观察组患者肠道双歧杆菌和乳杆菌数量高于对照组（均P＜0.05）。治疗后观察组患者IL-6、IL-8和TNF-α水平均低于对照组（均P＜0.05）。

双歧杆菌四联活菌片辅助标准铋剂四联疗法治疗可显著提高H. pylori感染患者H. pylori根除率,降低复发率和不良反应的发生率,改善肠道菌群分布,减轻患者的临床症状和炎症状态。

     

幽门螺杆菌重组腺病毒双价疫苗的构建及免疫学评价

幽门螺杆菌(Hp)是导致胃炎、消化道溃疡和胃癌的的主要病原菌.利用基因重组技术,成功将Hp的ure B和hsp A基因融合.将ure B-hsp A融合基因成功构建到腺病毒载体上.检测结果表明,该重组腺病毒具有侵染真核细胞能力,且能在真核细胞中表达目标抗原.以血清中IgG和新鲜粪便中sIgA,评价其免疫效果,结果显示,该重组腺病毒载体双价疫苗能在小鼠体内激发体液免疫和黏膜免疫反应.     

幽门螺杆菌致病岛CagL重组抗原的可溶性表达及其多克隆抗体的制备和分析*

目的:利用原核表达和蛋白质纯化技术获得高纯度的幽门螺杆菌致病岛CagL重组抗原(rCagL),利用其制备anti-CagL多克隆抗体,并分析抗体的特异性。方法:通过生物信息学软件分析rCagL的抗原结构;利用PCR长片段DNA合成技术合成不含有信号肽序列的幽门螺杆菌致病岛CagL基因,将其插入表达质粒pCzn1中,构建重组质粒pCzn1-rCagL。然后,将pCzn1-rCagL转入大肠杆菌Arctic Express中,经IPTG诱导表达后,通过Ni-IDA镍离子亲和层析纯化重组抗原rCagL,利用Western blot鉴定rCagL与His标签抗体和Anti-H. pylori抗体的免疫反应性;最后,通过rCagL辅以弗氏佐剂免疫BALB/c小鼠,制备anti-CagL多克隆抗血清,通过ELISA方法分析抗血清的特异性。结果:生物信息学软件表明重组抗原rCagL具有较好的抗原性质;重组质粒pCzn1-rCagL经双酶切和基因测序等技术鉴定,证实rCagL核苷酸序列与理论序列完全一致;基因工程菌株pCzn1-rCagL/Arctic Express在低温11℃条件经IPTG诱导表达。 SDS-PAGE实验结果证实:rCagL可实现相对高效地可溶性蛋白表达,可溶性蛋白约占包涵体的62.07%。经Ni-IDA亲和层析柱纯化,可获得高纯度rCagL,纯度约为96.6%。Western blot结果证实:重组抗原rCagL可特异性与His标签抗体和Anti-H. pylori抗体结合。ELISA结果证实:经rCagL免疫小鼠制备的多克隆抗体anti-CagL可特异性识别rCagL和H. pylori裂解物,具有较高的抗体特异性。结论:重组抗原rCagL在低温条件下可实现可溶性表达,经纯化可获得高纯度抗原蛋白;rCagL具有较好的抗原性,制备的多克隆抗体具有较好的免疫特异性,为发展H. pylori相关诊断试剂奠定了实验基础。     

乙肝疫苗对中小学生的保护效果

为进一步了解中小学生乙肝病毒的感染率及乙肝疫苗的保护效果,用固相放免方法检测1 134名小学生和358名中学生的HBsAg和抗-HBs。判定:S/N≥2.1;以≥10 mIU/mL为阳性。乙肝疫苗接种率,市区小学生高于郊区学生(χ2=54.58,P<0.01),HBsAg的阳性率呈下降趋势,检测到的1 134名小学生中,抗-HBs阳性率平均在89.2%。HBsAg阳性率随乙肝疫苗接种率的增高而下降,但市区学生(2.65%)与郊区学生(2.76%)差异无显著意义(χ2=1.35,P>0.05)。近期加强接种了重组乙肝疫苗的中学生,抗HBS-抗体阳性率97.7%。随着乙肝疫苗接种率和抗-HBs阳性率的增高,HBsAg阳性率呈下降趋势。在乙肝高发区,尽管推行了乙肝疫苗全程免疫规划,但从长远的免疫策略考虑,有必要制定加强免疫计划。     

粘膜免疫戊型肝炎试验性疫苗的研究

采用原核表达的戊型肝炎病毒结构区基因(HEV ORF2)编码蛋白,与新型人用疫苗佐剂类MF59配制成试验性疫苗,通过粘膜免疫途径免疫实验小鼠,研究其产生粘膜免疫和体液免疫的效果。结果表明,通过滴鼻和灌胃两种粘膜免疫途径免疫BALB／c小鼠,均能诱导小鼠产生针对HEV ORF2试验性疫苗的血清IgG和IgA,血清IgG的抗体滴度为1：800～1：1600,血清IgA抗体滴度为1：100～1：200。对免疫小鼠血清中IgG的动态观察表明,血清抗体可持续存在至少6个月以上。比较类MF159佐剂和传统铝盐佐剂经注射免疫所诱导产生的血清IgG抗体滴度,发现类MF59佐剂可有效增强HEV0RF2重组蛋白的免疫原性4倍左右。类MF159佐剂可诱导粘膜免疫反应,在肠道粘膜部位产生SIgA,滴度为1：100。这些结果为新型戊型肝炎病毒基因工程重组疫苗的研制提供了一条新的思路。     

Helicobacter pylori induces urease subunit B-specific CD8+ T cell responses in infected individuals via cytosolic pathway of cross-presentation

Background

Urease subunit B (UreB), a conserved and key virulence factor of Helicobacter pylori (H. pylori), can induce the host CD4⁺ T cell immune responses to provide protection, but less is known regarding CD8⁺ T cell responses. The characteristics of H. pylori-specific CD8⁺ T cell responses and the mechanism underlying antigen processing and presentation pathways remain unclear. This study was focus on protective antigen recombinant UreB (rUreb) to detect specific CD8⁺ T cell responses in vitro and elucidate the mechanism of UreB antigen processing and presentation.

Methods

The peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) collected from H. pylori-infected individuals were stimulated with rUreB in vitro to detect specific CD8⁺ T cell responses after co-culture with rUreB-pulsed autologous hMDCs. Through blocking assay, we investigated the potential pathway of UreB antigen processing and presentation via the cytosolic pathway or vacuolar pathway. The cytokines production of UreB specific CD8⁺ T cell were evaluated as well.

Results

We demonstrated UreB can induce specific CD8⁺ T cell immune responses in H. pylori infected individuals. Importantly, we characterized that UreB were mainly processed by proteasome instead of lysosomal proteases and presented through cytosolic pathway of cross-presentation, which requires endoplasmic reticulum–Golgi transport and newly synthesized MHC-I molecules, to induce functional-specific CD8⁺ T cell (IFN-γ + TNF-α + Grz A+ Grz B+) responses.

Conclusions

These results suggest that H. pylori UreB induces specific CD8⁺ T cell responses through cytosolic pathway of cross-presentation in infected individuals.