家蚕类泛素化翻译后修饰蛋白NEDD8的cDNA克隆、表达分析和亚细胞定位

【目的】NEDD8是一种重要的蛋白质翻译后修饰蛋白,对底物蛋白的功能具有重要的调节作用。本研究旨在探索家蚕Bombyx mori中NEDD8的功能。【方法】利用RT-PCR技术,从家蚕Bm N细胞中克隆了家蚕NEDD8完整的开放阅读框。通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术检测家蚕NEDD8在不同发育阶段、5龄第3天幼虫不同组织中以及Bm NPV感染Bm N细胞后的相对表达量。通过构建GFP融合表达的重组Bm NPV(B.mori nucleopolyherovirus)感染家蚕Bm N细胞,在共聚焦显微镜下观察NEDD8在细胞中分布情况,用GFP抗体进行Western blot验证。【结果】克隆获得了NEDD8基因。序列分析表明,家蚕NEDD8高度保守,与家蚕泛素蛋白氨基酸序列一致性最高。qRT-PCR分析结果表明,NEDD8在家蚕的不同组织中均有表达,其中头部中表达量最高,其次是丝腺中,而在精巢和卵巢中表达量最低;在家蚕5龄第3天幼虫始到化蛹后第3天NEDD8的表达量开始逐渐增加,化蛾后降至低水平;在家蚕杆状病毒感染Bm N细胞的早期和极晚期NEDD8的表达量都有明显增加。GFP-NEDD8融合表达定位显示NEDD8在Bm N细胞内普遍存在,分布于整个细胞中,并且在感染48 h后存在细胞质内的聚集现象。【结论】NEDD8编码序列在物种间高度保守;NEDD8在家蚕幼虫头部中表达量最高,在化蛹阶段表达量逐渐增加;NEDD8在Bm N细胞内普遍存在并且可能与参与Bm NPV复制。本研究所得结果为进一步研究NEDD8在家蚕中的生物学功能及修饰底物蛋白的作用机制奠定了基础。     

家蚕抗真菌因子BmSPI39对球孢白僵菌入侵的表达响应

[目的]制备家蚕Bombyx mori抗真菌因子BmSPI39的多克隆抗体,分析BmSPI39对球孢白僵菌Beauveria bassiana入侵的表达响应.[方法]利用原核表达和固定化镍离子亲和层析技术获得高纯度的BmSPI39重组蛋白,利用胶内活性染色检测重组蛋白BmSPI39对枯草杆菌Bacillus subti...     

转座子介导的多角体基因表达及提高病毒粒子的感染效率

现行的杆状病毒表达外源基因的方法是将外源基因取代病毒中的多角体基因,因而得到的重组杆状病毒感染活体时不能经口感染,只能进行针刺注射,效率低且易引起活体感染其他疾病。将家蚕核型多角体病毒(Bombyx mor inucleopolyhedrovirus,BmNPV)中的多角体基因(polyhedrin,poly)及其启动子片段克隆到转座子载体pigA3GFP中,将其与辅助质粒pHA3PIG利用脂质体介导法导入家蚕细胞中,经过多次筛选获得稳定的转基因家蚕细胞。之后先将BmPAK6(含LacZ)及BmGFP(含GFP)重组病毒分别感染转基因细胞,再将得到的重组病毒经口感染5龄家蚕幼虫。结果显示,重组杆状病毒可以经口感染家蚕幼虫。这些研究表明来自于转基因家蚕细胞的poly基因表达产物可以提高重组杆状病毒经口感染家蚕率,为解决杆状病毒表达系统中重组病毒不能经口感染家蚕幼虫的问题提供新思路。     

30K蛋白对家蚕细胞及幼虫存活的作用

利用杆状病毒表达系统在家蚕BombyxmoriL.细胞BmN中表达家蚕30K蛋白,以亲本病毒BmPAK6为对照,将重组病毒Bm/r-30K分别感染BmN细胞及家蚕幼虫,观察其感染后不同时间的凋亡及存活率。与对照相比,重组病毒感染后的BmN细胞的存活率明显高于对照组,并且感染的家蚕幼虫存活时间也较长,表明体内过量表达家蚕30K蛋白有助于延长其细胞及幼虫的存活。     

家蚕丝蛋白Fhx/P25基因启动子区域的克隆及序列分析

为研究家蚕Fhx/P25基因在时空上的调控机制,通过PCR扩增获得家蚕丝素蛋白Fhx/P25基因的启动子序列并进行克隆和序列分析。进一步构建了由Fhx/P25启动子驱动报告基因DsRed的表达载体pSK-P25-DsRed-PolyA,并通过家蚕BmN细胞进行瞬时表达。结果显示:Fhx/P25基因的启动子序列符合真核生物启动子特点,具有丝腺特异性表达启动子的特征,TATA框的保守序列为TATAA,位于-28—-32处,CAAT基序有3个,其中-110—-117和-90—-87处的2个CAAT基序可能具有活性;二级结构分析显示:Fhx/P25启动子区域具有复杂的茎环结构,这可能与蛋白表达的组织特异性、时间性以及活性有关。基因启动子可以驱动红色荧光基因DsRed在家蚕BmN培养细胞中的瞬时表达。     

家蚕细胞和虫体产生抗人小细胞肺癌抗体

用重组昆虫病毒表达系统,在家蚕细胞和虫体表达了抗人小细胞肺癌人-鼠嵌合抗体。重组病毒rNPVL2,rNPVH17及双重组病毒rNPVLH19感染的家蚕细胞和虫体血淋巴中都检测到抗体分子的表达。双重组病毒的双基因共表达部分产物可装配。ELISA分析表明抗体重轻链基因共表达产物具有比单基因表达产物高得多的与小细胞肺癌细胞免疫结合功能。     

非转座子载体介导的稳定转化家蚕BmN细胞表达人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子

为了建立非转座子载体介导的持续表达外源基因的转化家蚕BmN细胞系,将家蚕核型多角体病毒极早期基因(ie-1)启动子控制的人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(hGM-CSF)基因的表达盒克隆至pIZT/V5-His,获得重组载体pIZT-IE-hGM-CSF,该载体转染家蚕BmN细胞后,通过博莱霉素(Zeocin)筛选获得了稳定转化细胞系IE-hGM-CSF。转基因细胞基因组经PCR鉴定,成功检测到ie-hGM-CSF,Western blotting分析结果显示转化细胞表达的重组hGM-CSF的大小为22kDa,ELISA检测结果显示hGM-CSF在转化细胞系里的表达水平大约为2814.7pg/106个细胞。     

家蚕丝素蛋白轻链基因（fib-L）启动子序列的克隆及其活性分析

家蚕Bombyx mori丝素蛋白轻链（fibroin light-chain, fib-L）基因fib-L具有在后部丝腺组织专一性、高效性表达的特点。为了利用其启动子构建能够表达外源基因的丝腺生物工厂,本实验对fib-L启动子活性进行了研究。通过PCR法克隆了fib-L启动子元件,序列分析显示fib-L启动子由位于-33 ～ -25处的TATA盒元件和位于－128～－121处的特征性序列GTCAATTT共同组成。用fib-L启动子控制报告基因DsRed进行家蚕BmN细胞和蚕体内的瞬时表达研究,结果表明fib-L启动子可以驱动DsRed报告基因在BmN细胞和家蚕后部丝腺组织中瞬时表达。     

A new Bombyx mori larval ovarian cell line highly susceptible to nucleopolyhedrovirus

Lepidopteran cell lines constitute the backbone for studying baculoviral biology in culturo and for baculovirus vector based recombinant protein expression systems. In the present study, we report establishment of a new continuous cell line designated as DZNU-Bm-1 from larval ovaries of the silkworm, Bombyx mori. The cells were grown in MGM-448 insect cell culture medium supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS) and 3% heat inactivated B. mori haemolymph at 25+/-1 degrees C. A large number of attached epithelial-like and round refractive cells migrated from the explants and multiplied in the primary cultures. Both type of cells were subcultured initially for a few passages but after 10 passages the round refractive cells dominated the population, which could be subcultured continuously using MGM-448 medium with 10% FBS. The population doubling time of cell line was about 42h at 25+/-1 degrees C. The cell populations were largely diploids and triploids, while a few tetraploids and hexaploids were also observed. DNA profiles using Inter Simple Sequence Repeat (ISSR)-PCR and Simple Sequence Repeat (SSR) loci established the differences between DZNU-Bm-1 cell line and most widely used BmN cell line and the B. mori W-chromosome specific sequences confirmed the origin of DZNU-Bm-1 cell line to be from female silkworm. When cells were infected with free nonoccluded B. mori nucleopolyhedrovirus (BmNPV), the cell line was found to be highly susceptible with 92-94% of the cells harbouring BmNPV and having an average of 20-23 OBs/infected cell. We suggest the usefulness of this cell line in BmNPV based baculoviral expression system and also for studying in culturo virus replication.     

抗人CD28单链抗体基因的构建及在BmN细胞和家蚕中的表达

采用TP-PCR法,将抗人CD28单链抗体的重、轻链可变区基因和人工设计的昆虫杆状病毒多角体蛋白基因(ph)偏好的连接肽序列,拼接成抗人CD28单链抗体(抗CD28-ScFv)基因,并将其插入昆虫杆状病毒转移载体pBacPAK8的ph启动子,构建成重组转移载体pBacPAK8/CD28-ScFv。为便于表达产物的纯化,在CD28-ScFv的C端增加了6×Histag序列。通过脂质体介导法将重组转移载体pBacPAK8/CD28-ScFv和线性化病毒Bm-BacPAK6共转染BmN细胞,经空斑分析和蓝白斑筛选,获得重组杆状病毒Bm-BacPAK6 CD28-ScFv。将重组病毒Bm-BacPAK6 CD28-ScFv感染BmN细胞和5龄家蚕,SDS-PAGE和Western Blotting分析表明,在分子量约为28kD处有一表达带。BmN细胞的表达始于24h,表达峰在72h,96h时表达量开始下降,而5龄家蚕的表达始于48h,表达峰在120h。结果证明,抗人CD28单链抗体基因在BmN细胞和家蚕中得到了特异性表达。上述研究成果为抗人CD28基因工程抗体的研制奠定了基础。     

家蚕表达人表皮生长因子gp67信号肽融合蛋白及生物活性的研究

人表皮生长因子(hEGF), 一种由53个氨基酸残基组成的单链多肽, 具有广阔的应用前景。本文主要探讨家蚕表达人表皮生长因子gp67信号肽融合蛋白的生物活性。采用家蚕杆状病毒表达系统来表达该信号肽融合蛋白。构建了重组质粒pBacPAKS-hEGF, 将该重组质粒与线性化病毒Bm-BacPAK6 DNA共转染家蚕细胞, 筛选获得重组病毒vBacPAK-SEGF, 用vBacPAK-SEGF感染家蚕BmN细胞和五龄蚕, Western blot检测表明在家蚕细胞、五岭幼虫的血淋巴和蛹中均有约12 kD的目的蛋白表达。ELISA检测发现在家蚕细胞中的表达量为23 mg/ 106细胞, 五龄幼虫中的表达量可达到82 mg/mL血淋巴。利用小鼠成纤维细胞Balb/c3T3分析家蚕表达的hEGF信号肽融合蛋白的生物活性, 结果表明表达产物能显著促进Balb/c3T3细胞的增值。另外, 研究还发现hEGF信号肽融合蛋白可使新生ICR小鼠体重增 加, 睁眼和萌齿时间提前。本研究为进一步开发利用家蚕表达的hEGF提供理论基础。     

创建可视化的家蚕杆状病毒表达系统表达家蚕二分浓核病毒非结构蛋白NS1

重组杆状病毒感染昆虫细胞是表达外源蛋白常用的一种方法。为有效鉴定转染的细胞中是否产生了重组病毒粒子,对质粒pFastBacI进行改造,构建了极早期基因ie1启动子控制的绿色荧光蛋白egfp基因表达盒,以及多角体基因启动子控制的外源DNA的一个通用型双表达载体;通过酶切、连接的方式,将家蚕二分浓核病毒ns1基因连接到多角体启动子下游;在转座酶的介导下,该供体质粒上部分序列可转座到穿梭载体Bm-Bacmid上,进而构建可同时表达egfp和ns1基因的重组杆粒。将构建的该重组杆粒DNA转染BmN细胞,通过观察可视化的绿色荧光信号,可迅速判定转染后的细胞中重组病毒粒子产生的情况,收集转染后的细胞培养上清,将其感染BmN细胞,对感染4 d后的细胞总蛋白进行Western blotting分析,结果表明能杂交到一条36 kDa大小的特异蛋白,表明NS1蛋白成功获得了表达,进而为深入研究ns1基因的功能奠定了基础。     

LncRNA63及其共表达基因Hr3在家蚕中的表达和功能分析

【目的】本研究旨在通过对一个新的长链非编码RNA (long non-coding RNA, lncRNA)及其共表达基因在家蚕Bombyx mori中的表达和功能进行分析,进一步阐明lncRNA在调控家蚕变态发育中的分子机制。【方法】基于前期家蚕脂肪体转录组测序数据,我们发现在蜕皮激素20E(2 μg/μL)处理5龄幼虫早期的脂肪体中lncRNA63表达显著上调,家蚕激素受体基因Hr3与之共表达。利用qRT-PCR对lncRNA63和Hr3在家蚕不同发育时期(4-5龄幼虫、蛹和成虫)、5龄幼虫不同组织(头、体壁、血淋巴、中肠、马氏管、脂肪体、丝腺、精巢和卵巢)和2 μg/μL 20E处理2, 6, 12和24 h后5龄幼虫脂肪体中的表达谱进行分析;采用核质分离检测和原位杂交技术检测lncRNA63在家蚕BmN细胞中的定位;利用dsRNA干涉家蚕5龄幼虫个体中lncRNA63的表达,并利用qRT-PCR检测RNA干涉lncRNA63对头、丝腺、脂肪体和体壁中Hr3表达的影响。【结果】qRT-PCR结果表明,lncRNA63和Hr3在家蚕羽化前的蛹末期有一个表达高峰;二者在家蚕5龄幼虫头、体壁和丝腺中都有较高表达;lncRNA63和Hr3在2 μg/μL 20E处理2, 6和12 h的家蚕5龄幼虫脂肪体中较对照组(无水乙醇处理组)都显著上调,24 h下降到与对照组相当水平,二者的表达趋势完全一致。LncRNA63主要定位于BmN细胞核,但20E可诱导lncRNA63的核质迁移。利用dsRNA干涉lncRNA63表达后,Hr3的表达显著下调。【结论】20E不仅可调控lncRNA63的表达,还可诱导lncRNA63的核质迁移;lncRNA63可通过调控共表达基因Hr3的表达参与家蚕的变态发育过程。     

Identification and characterization of host factors interacting with Bombyx mori nucleopolyhedrovirus ORF8

The orf8 gene (Bm8) in Bombyx mori nucleopolyhedrovirus (BmNPV) is one of 17 genes unique to group I NPVs and is expressed as an early gene. We have reported that Bm8 may play an important role during viral infection and that Bm8 protein co-localized with IE1 to specific nuclear foci throughout infection. It was also demonstrated that both IE1 and BmNPV hr facilitate this localization of Bm8. To investigate further, host proteins interacting with Bm8 were screened using a yeast two-hybrid system. We identified 6 host clones as Bm8-interacting partners from three cDNA libraries derived from BmN cells or B. mori larvae. Further assays showed that the N-terminal region of Bm8 is important for the interaction with most host clones and that two of the clones can associate with IE1. Cloning and sequencing of full-length cDNAs revealed that most of the clones potentially encode either membrane-bound proteins or secreted proteins. Quantitative RT-PCR analysis revealed that some of these host genes were slightly induced during the early stage of infection in BmN cells, and that the expression of all genes was markedly reduced during the late stage of infection. Generation of mutant BmNPVs over-expressing these host genes also identified a gene that potentially functions as a negative factor during BmNPV infection. These features of Bm8-interacting host proteins strongly support that Bm8 is a multifunctional protein involved in multiple signaling pathways in host cells.     

Expression of the hIGF-I gene driven by the Fhx/P25 promoter in the silk glands of germline silkworm and transformed BmN cells

The expression of the human insulin-like growth factor (hIGF-I) gene driven by the Fhx/P25 promoter in the silk glands of transgenic silkworms (Bombyx mori) and in transformed silkworm cells, was achieved using BmN cells transfected with a piggyBac vector, pigA3GFP-Fhx/P25-hIGF-ie-neo containing a neomycin-resistance gene (neo), a green fluorescent protein gene (gfp), an hIGF-I gene, and a helper plasmid containing the piggyBac transposase sequence under the control of the B. mori actin 3 (A3) promoter. We selected stably transformed BmN cells expressing hIGF-I using the antibiotic G418. The expression level of hIGF-I was about 450 pg in 3 × 10(6) cells, determined by ELISA. The piggyBac vector was transferred into the silkworm eggs using sperm-mediated gene transfer. The expression level of hIGF-I per gram fresh posterior silk glands of G4 transgenic silkworms was approx. 150 ng.     

家蚕微孢子虫海藻糖酶3的表达、定位及功能

【目的】本研究旨在初步明确家蚕微孢子虫Nosema bombycis海藻糖酶3(NbTre3)的功能,为家蚕Bombyx mori微粒子病的防治提供理论依据和线索。【方法】通过PCR扩增NbTre3,构建原核表达载体pET28a-NbTre3;经IPTG诱导在大肠杆菌Escherichia coli中表达重组蛋白NbTre3,Western blot检测目的蛋白;Ni柱亲和层析法对重组蛋白NbTre3进行纯化,用获得的NbTre3免疫新西兰兔制备多克隆抗体;利用间接免疫荧光技术对成熟家蚕微孢子虫中的NbTre3进行定位;qRT-PCR检测家蚕微孢子虫感染家蚕5龄起蚕后不同时间中肠中NbTre3的转录水平;通过分别注射siRNA-1, siRNA-2和siRNA-3进行RNAi,qRT-PCR检测RNAi后不同时间感染家蚕微孢子虫的家蚕5龄起蚕中肠中NbTre3和16S rRNA的转录水平。【结果】成功纯化并获得重组目的蛋白NbTre3,大小约为34 kD。免疫新西兰兔后,收集血清,纯化获得NbTre3多克隆抗体,经Western blot鉴定正确。间接免疫荧光结果显示NbTre3主要分...     

家蚕生殖细胞相关基因nanos的克隆表达及在胚胎发育中的表达模式

【目的】探讨nanos基因在家蚕Bombyx mori胚胎发育中的表达模式,为进一步研究该基因在家蚕胚胎发育中的功能奠定基础。【方法】根据本实验室提交到GenBank中家蚕nanos的cDNA序列(登录号EF647589)设计引物,扩增出了一条长684 bp的编码片段,对该片段进行了克隆和表达,亲和纯化表达的蛋白并免疫新西兰大白兔制备抗体。Western blot检测家蚕早期胚胎nanos的表达情况,荧光定量PCR检测nanos在整个家蚕胚胎发育中的表达情况。【结果】克隆并表达了一条长684 bp的编码片段,得到了分子量约33 kD的融合蛋白。用制备的抗血清对家蚕早期胚胎蛋白的Western blot检测表明,nanos在此阶段基本是恒定表达。荧光定量PCR结果显示刚产的卵中nanos的表达量最大,第2天开始急剧下降,此后到第10天表达量几乎没有变化。【结论】本实验克隆的nanos是家蚕中的一个同源物,该基因在家蚕胚胎发育中的表达模式与蜜蜂等有很大的不同,反映了昆虫生殖细胞形成机制的多样性。     

家蚕生存素基因在BmN4细胞有丝分裂中的功能分析

【目的】阐明生存素基因在家蚕Bombyx mori BmN4细胞有丝分裂中的功能。【方法】qRT PCR分析家蚕生存素基因BmSurvivin在家蚕5龄第3天幼虫不同组织(丝腺、中肠、马氏管、精巢、卵巢、脂肪体、皮细胞层和表皮)中的表达量;构建pIZT/V5-His-BmSurvivin-GFP (BG)融合载体并转染BmN4细胞,以免疫荧光标记检测BmSurvivin和第10位丝氨酸(Ser10)磷酸化的组蛋白H3(H3Ser10ph)在BmN4细胞有丝分裂分裂不同时期的定位。【结果】BmSurvivin在家蚕5龄第3天幼虫马氏管中表达量最高,其次是在丝腺和中肠中。成功构建pIZT/V5-His-BmSurvivin-GFP载体。免疫荧光结果显示,在BmN4细胞间期核中可以看到明显的GFP信号,涵盖了细胞核和细胞质区域,指示BmSurvivin的定位;随着细胞进入分裂期,GFP信号指示BmSurvivin与染色质共定位,待细胞形成明显的双取向时在纺锤体区域也可以看到GFP信号;后期随着姐妹染色单体分开,GFP信号指示BmSurvivin定位在染色质及胞质分裂区;末期随着两个新的子细胞形成GFP信号指示BmSurvivin仅定位在胞质分裂区。H3Ser10ph定位在BmN4细胞前中期染色质凝缩处,至中期信号最强,与整条染色体重合,后期信号消失。【结论】BmSurvivin与有丝分裂周期中染色质和纺锤体的动态变化相关。