成熟志贺毒素全长与截短A亚单位在E.coli中的表达及纯化

应用PCR技术从Ⅰ型痢疾志贺菌(Shigella dysenteriaetype I)中,扩增出约895 bp的成熟ShT-A基因片段,克隆至pGEM-T载体中,经蓝白斑筛选、PCR和双酶切鉴定正确后,命名为pGEM-TA2。测序结果表明,ShT-A与GenBank中ShT-A序列完全一致。用BamHⅠ和KpnⅠ双酶切克隆质粒,得到为895 bp成熟ShT-A与pQE30原核重组表达载体连接,构建原核重组表达质粒。经IPTG诱导,SDS-PAGE电泳观察,没有目的蛋白表达。DNAsis软件分析ShT-A基因序列,发现513 bp处有HindⅢ位点,故以ShT-A上游引物的BamHⅠ和HindⅢ从pGEM-TA2切出一个513 bp的截短片段,重新插入pQE30表达载体,得到pQE30-A513重组表达质粒,转化E.coliM15,经IPTG诱导,SDS-PAGE电泳观察,在20 ku处出现1条特异性的表达蛋白带,与截短ShT-A513分子量相符,表达量约占菌体总蛋白的37.4%,表达形式为包涵体。为抗体的制备提供了必要的物质基础。     

PCR结合酶切-序列比对法鉴定B群脑膜炎奈瑟菌菌株

目的用PCR结合酶切-序列比对法对B群脑膜炎奈瑟菌菌株进行鉴定。方法用玻片凝集法对不同来源的15株B群脑膜炎奈瑟菌菌株进行初步检定,再用PCR结合酶切-序列比对法对上述15株菌株进行进一步鉴定,即用PCR结合酶切法扩增菌株的唾液酸转移酶sia D基因并对PCR产物进行酶切后,用BLAST软件将PCR产物测序结果与Gene Bank中原始sia D序列比对。结果 15株菌株玻片凝集结果均为阳性;15株菌株的PCR产物片段大小均为460 bp;TaqⅠ酶切后,13株菌株的酶切产物片段大小仍为460 bp,其PCR产物测序比对结果与B群脑膜炎奈瑟菌原始sia D序列同源性均达到99%;其余2株酶切产物片段大小约200 bp,与C群脑膜炎奈瑟菌sia D原始基因序列同源性分别为98%和99%。结论 15株菌株经PCR结合酶切-序列比对法鉴定,13株为B群脑膜炎奈瑟菌菌株,2株为C群脑膜炎奈瑟菌菌株;该方法可准确鉴定B群脑膜炎奈瑟菌菌株。     

志贺毒素B（ShT-B）亚单位在两种表达载体中表达形式分析

用KpnⅠ和HindⅢ双酶切pGEMTB3克隆质粒,得到大小约为225bp的ShTB基因片段,分别将其插入到经双酶切的pQE40和pQE30表达载体中,构建了2个ShTB的重组表达质粒pQE40B3和pQE30B2,分别转化到E.coliM15,经IPTG诱导后,重组质粒目的蛋白均得到表达。其中,pQE40B3表达蛋白约占菌体总蛋白的37%,主要为包涵体形式。pQE30B2表达蛋白约占菌体总蛋白的16%,主要为可溶性形式,约9.2%。为重组抗原的制备提供了必要的物质基础。     

基于重叠延伸PCR构建幽门螺杆菌MreB重组载体

[目的]基于重叠延伸PCR技术,构建串联亲和层析标签(TAP)标记的幽门螺杆菌骨架蛋白Mre B的重组质粒。[方法]将幽门螺杆菌Mre B基因终止密码子TAA前DNA序列(Mre Ba)、TAP和终止密码子TAA后的DNA序列(Mre Bb),通过重叠延伸PCR进行连接,形成大小约3.1 kb的融合片段Mre BCF;Mre BCF片段经XhoⅠ酶切、纯化后,克隆到经SmaⅠ和XhoⅠ双酶切的线性载体p K18mob Sac B上。[结果]PCR、酶切及DNA测序的结果表明,重组质粒p K18Mre BCF包含大小约为740 bp、1 400 bp和1 000 bp的三个片段(Mre Ba、TAP和Mre Bb),并且这三个片段的接头连接及核苷酸序列完全正确。[结论]利用重叠延伸PCR可对多个片段进行无缝连接,简便、高效地构建重组质粒;成功构建了重组质粒p K18Mre BCF,为将来幽门螺杆菌Mre B蛋白功能复合体的分离和鉴定奠定了基础。     

葡萄病毒B的RT-PCR检测技术研究

旨在建立适合葡萄的葡萄病毒B的RT-PCR检测技术。从感染葡萄病毒B的葡萄皮层中提取总RNA,以其为模板合成cDNA第一链,并利用两对引物分别进行PCR扩增;回收PCR特异扩增产物,与pUCm-T载体连接,并进行转化、重组克隆的筛选、重组质粒的酶切鉴定和序列测定。结果显示,两对引物均能获得与预期片段大小一致长约460 bp和470 bp的扩增产物扩增片段序列与已报道GVB序列(序列号:X75448)的核苷酸同源性均为81%,经反复多次试验证实,利用总RNA为模板合成cDNA并进行PCR扩增检测GVB是准确、可靠的。     

利用多重PCR反应同时筛选番茄Cf-9和Tm-1基因

利用同一PCR反应体系,对分别与番茄抗叶霉病的Cf-9基因和抗番茄烟草花叶病毒病的Tm-1基因紧密连锁的PCR标记进行了同时扩增筛选,扩增的特异性片段与单引物扩增片段吻合。其中与Cf-9基因紧密连锁的CAPs标记在抗感试材均可扩增出560bp的特异片段,且都存在TaqⅠ酶切位点,抗病基因型酶切后分别产生了450bp、330bp和290bp的不同特异性片段,而感病基因型试材酶切后产生450bp和290bp的特异性片段;与Tm-1基因紧密连锁的SCAR标记为显性标记,只有抗病试材产生750bp的特异片段,不能被TaqⅠ酶切。经反复验证,结果稳定准确,可用于在同一PCR反应体系中对两个抗病基因进行同时筛选鉴定。该体系的建立不仅省时、省工、节省费用,而且可用于苗期辅助选育,加快番茄抗病育种进程。     

小麦6B染色体微切割及其不同片段的DNA文库构建

用Nd∶YAG激光微束将处于有丝分裂中期的小麦(Triticum aestivum L.)6B染色体微切割为四段,并用微细玻璃针将每个片段分别回收。将分离的染色体片段DNA用Sau3A接头介导的多聚酶链式反应(LA-PCR)分别扩增。Southern杂交证明4个特定区域的DNA确实来自于小麦基因组。用一系列(42对引物)位于6B染色体和其他染色体上的微卫星序列对微切割的染色体片段的PCR产物进行了验证。结果表明,获得的染色体片段的PCR产物来自于小麦6B染色体。将6B染色体4个片段的第二轮PCR产物克隆到pGEMT-vector中,建立了4个染色体特定区域的基因组文库,命名为R1、R2、R3和R4,分别包含2.1×10~5、2.74×10~5、2.45×10~5和2.93×10~5个重组子克隆。每个文库均随机挑选150个克隆进行质粒的小量制备和酶切验证。结果显示:插入片段大小在300～1800 bp之间,平均大小为820～870 bp,其中43％～48％的克隆为低/单拷贝序列,42％～47％为中/高拷贝序列。本研究为详细分析植物单染色体的不同片段的分子遗传学研究提供了基础。     

三色书虱体内共生微生物Wolbachia的wsp基因的分子检测

采用常规PCR和巢式PCR方法对三色书虱Liposcelis tricolor体内的共生微生物Wolbachia的wsp基因进行分子检测;通过Wolbachia的通用引物以及A、B亚群引物分别比较了常规PCR和巢式PCR对wsp基因扩增的灵敏性。从三色书虱体内扩增出了610bp的Wolbachia的wsp基因片段,500bp的WolbachiaA亚群的wsp基因片段和450bp的Wolbachia B亚群的wsp基因片段。扩增结果说明三色书虱被A和B两个亚群的Wolbachia混合感染;巢式PCR比常规PCR更为灵敏。     

小麦6B染色体微切割及其不同片段的DNA文库构建

用Nd:YAG激光微束将处于丝分裂中期的小麦(Triticum aestivum L.)6B染色体微切割为四段,并用微细玻璃针将每个片段分别回收.将分离的染色体片段DNA用Sau3A接头介导的多聚酶链式反应(LA-PCR)分别扩增.Southem杂交证明4个特定区域的DNA确实来自于小麦基因组.用一系列(42对引物)位于6B染色体上的微卫星序列对微切割的染色体片段的PCR产物进行了验证.结果表明,获得的染色体片段的PCR产物来自于小麦6B染色体.将6B染色体4个片段的第二轮PCR产物克隆到pGET-vector中,建立了4个染色体特定区域的基因组文库,命名为R1、R2、R3和R4,分别包含2.1×105、2.74×105和2.93×105个重组子克隆.每个文库均随机挑选150个克隆进行质粒的小量制备和酶切验证.结果显示;插入片段大小在300～1800之间,平均大小为820～870bp,其中43%～48%的克隆为低/单拷贝序列,42%～47%为中/高拷贝序列.本研究为详细分析植物单染色体的不同片段的分子遗传学研究提供了基础.     

高效产氢菌B49菌株adh和L-ldh基因克隆及序列分析

设计细菌adh基因和L-ldh基因简并引物, 采用降落PCR并结合Cassette PCR方法从高效产氢菌B49中扩增全长基因。共获得两段基因组DNA片段。其中一段序列长1902 bp, 包括adh基因开放阅读框1101 bp, 共编码366个氨基酸, 编码产物分子量为39.71 kD, 理论等电点为pH 5.93。该基因与Clostridium thermocellum ATCC 27405的adh位点序列一致性为73%。另一段序列长2490 bp, 包括L-ldh基因开放阅读框951 bp, 共编码316个氨基酸, 编码产物分子量为34.23 kD, 理论等电点为pH 6.09。该基因与Bacillus megaterium的L-ldh位点一致性为74%。试验结果表明, 采用CodeHop和Genefisher程序化设计的简并引物可信性强, 阳性率高, CodeHop设计简并引物效果要好于Genefisher。adh和L-ldh的成功克隆为通过代谢工程手段敲除adh和L-ldh基因提供了科学依据, 从而为进一步提高B49产氢能力的代谢工程研究奠定基础。     

编码Ag85A基因突变体的设计与合成

自行设计和合成可转录mRNA不能翻译功能性蛋白分子的全长Ag85A编码基因突变体(Ag85A-M),克隆至真核表达载体pIRES2-EGFP,用于后续制备Ag85A-M疫苗,研究双股Ag85 DAN疫苗是否能通过RNA传感器提呈抗原信息,诱导固有和适应性免疫应答。设计Ag85A-M基因,将编码Ag85A基因(891 bp)中的第114位和230位的碱基C突变为G,使之含有TAG和TGA双重翻译终止子。合成Ag85A(M)全基因片段,利用普通PCR方法按照设计将Ag85A(M)全基因序列分别拆分成332 bp(A)、332 bp(B)、264 bp(C)三个小片段和488 bp(D)、423 bp(E)两个小片段进行扩增合成。构建pIRES2-EGFP-Ag85A(M)载体,将Ag85A(M)全长基因片段通过pIRES2-EGFP载体多克隆位点(multiple clone site, MCS)中双酶切位点EcoR I/BamH I插入载体,再经双酶切和基因测序鉴定,DC2.4中基因表达确认。结果显示,采用普通PCR法分段扩增合成获得与预先设计的长度一致的A、B、C、D和E小片段,合成的Ag85A-M的全部序列(891 bp)、突变位置和碱基正确。三片段拆分(A、B和C小片段)阳性克隆率平均值为87.67%,基因保真度为90.33%。二片段拆分(D和E小片段)阳性克隆率平均值为81.5%,基因保真度为23%。结果表明,本研究获得了可用于后续研究的含有114和230位点突变的全长Ag85A-M DNA片段,三片段基因拆分方法获得的332 bp及以下片段PCR法合成保真度显著高于二片段拆分方法获得的423 bp及以上片段。     

高效产氢菌B49菌株adh和L-ldh基因克隆及序列分析

设计细菌adh基因和L-ldh基因简并引物,采用降落PCR并结合Cassette PCR方法从高效产氢菌B49中扩增全长基因.共获得两段基因组DNA片段.其中一段序列长1902 bp.包括adh基因开放阅读框 1101 bp,共编码366个氨基酸,编码产物分子量为 39.71 kD,理论等电点为pH5.93.该基因与Clostridium thermocellum ATCC 27405的adh位点序列一致性为73%.另一段序列长2490bp,包括L-ldh基因开放阅读框951 bp,共编码316个氨基酸,编码产物分子量为34.23 kD,理论等电点为pH 6.09.该基因与Bacillus megaterium的L-ldh位点一致性为74%.试验结果表明,采用CodeHop和Genefisher程序化设计的简并引物可信性强,阳性率高,CodeHop设计简并引物效果要好于Genefisher.adh和L-ldh的成功克隆为通过代谢工程手段敲除adh和L-ldh基因提供了科学依据,从而为进一步提高B49产氢能力的代谢工程研究奠定基础.     

融合酶表达载体的构建及出现问题的初探

目的:将限制性内切酶FokⅠ催化区域基因(631bp)和PI-SceⅠ识别区域的基因(546bp)连接到一起,克隆入载体质粒pET28a+中,为表达新的限制性内切酶融合酶做准备。方法:分别以啤酒酵母和海床黄杆菌作模板,PCR扩增PI-SceⅠ和FokⅠ基因片段,再将它们克隆入载体质粒pET28a+,然后对整合质粒进行双酶切检测。结果:整合过程中,无论是PI-SceⅠ还是FokⅠ基因片段,都能单独成功插入载体,但当插入第二段基因片段时,酶切结果显示大约600bp的基因片段缺失了。结论:缺失可能因为两段连在一起的新基因在转化过程中对宿主细胞有毒性,宿主细胞对其进行了剪切;也可能这两段基因会形成某种高级结构而导致其不能很好的连接,产生缺失现象。     

海藻糖合酶产生菌筛选、鉴定及目的基因克隆

目的:为筛选出一株产海藻糖合酶的菌株,并以此菌的全DNA为模板,克隆出产海藻糖合酶的目的基因片段。方法:实验过程中采用了常规筛选菌种、快速提取细菌全基因、显微镜观察菌种、热启动PCR技术、电泳纯化回收基因片段、EcoRⅠ和HindⅢ双酶切鉴定目的基因片段等方法。结果:在电镜下可观察到有芽孢、杆菌;菌株16S rRNA基因扩增产物共计1490个碱基;PCR方法扩增出阳性克隆大约1700bp的基因片段。结论:通过生理、形态、结构特征分析及16S rRNA基因全序列比较得出结论:筛选到一株短小芽孢杆菌;PCR扩增出阳性克隆片段,全长1722bp,为实验所要的编码海藻糖合酶的基因片段。     

由基因序列开发番茄枯萎病抗性基因Ⅰ-2的共显性分子标记

根据Ⅰ-2的基因序列设计特异扩增引物对Ⅰ-2/5F和Ⅰ-2/5R,扩增Ⅰ-2基因3 132～3 765 bp之间片段,基因型为Ⅰ-2/Ⅰ-2的材料03F-7可扩增出633 bp的条带.而基因型为I-2/I-2的材料Moneymaker可扩增出693 bp的条带,杂合型材料可扩增出以上2个条带.通过这两个特异扩增片段的克隆和测序证明,抗病材料扩增的633 bp片段为Ⅰ-2基因的3 132～3 765 bp之间的序列,而感病等位基因中出现大量的碱基突变和60 bp片段插入.利用引物对Ⅰ-2/5F和Ⅰ-2/5R,可区分纯合抗病材料、杂合抗病材料和纯合感病材料,从而建立了Ⅰ-2基因的共显性分子标记.在此基础上,利用该标记对16个主要番茄品种进行基因型鉴定,8个品种含有,Ⅰ-2基因,其中1个品种基因型为Ⅰ-2/Ⅰ-2,其他品种为Ⅰ-2/I*2.通过一次PCR和一次HindⅢ酶切建立了Ⅰ-2和Tm-22双基因检测体系,为多基因鉴定及标记辅助选择提供了有力工具.     

广东汉族人载脂蛋白B(apoB)基因3′端VNTR的遗传多态性研究

随机抽提100例无血缘关系的广东汉族人的血痕DNA,用PCR法扩增载脂蛋白B(apolipoprotein B apoB)基因3′端的VNTR,共检出19个等位基因,片段大小分布在510～1200bp之间,等位基因频率为0.005—0.195,杂合度为88.80％,父权排除率为0.6395,其等位基因数目及频率分布均与英国白种人的有差异。家系分析表明扩增片段按孟德尔方式遗传。本实验证实了apoB基因3′端VNTR的高度多态性和高度杂合性。     

多重PCR检测奶牛乳腺炎金黄色葡萄球菌粘附素基因clfa A、clfa B、fnbp A和fnbp B

利用多重PCR检测金黄色葡萄球菌粘附素基因clfa A、clfa B、fnbp A和fnbp B的方法,对奶牛乳腺炎金黄色葡萄球菌临床分离株进行聚集因子主效基因的分析。通过设计合成的特异性引物对金黄色葡萄球菌模板进行PCR扩增,将目的基因回收并连接到T载体,鉴定后进行测序验证,然后对本实验室所分离鉴定的金葡菌临床分离株进行多重PCR检测。PCR产物经过电泳成像显示,clfa A和clfa B分别在292bp和205bp处出现特异性条带;fn-bp A和fnbp B分别在524bp和642bp处出现特异性条带。通过对29株金葡菌临床分离株多重PCR检测发现:能扩增出clfa A、clfa B、fnbp A和fnbp B的分别有26株、12株、28株和3株。建立的多重PCR检测金黄色葡萄球菌粘附素基因的方法具有良好的特异性和可靠性,并且发现clfa A和fnbp A基因存在于绝大部分的金黄色葡萄球菌中。     

芸薹属类黄酮3'-羟化酶基因家族RNA干扰载体的构建

目的：构建芸薹属类黄酮3′羟化酶（F3′H）基因家族的RNAi载体。方法：采用PCR克隆了607bp的芸薹属F3’H基因家族的RNAi片段,将其反义片段、正义片段分别采用NcoⅠ＋AatⅡ、BamHⅠ＋XbaⅠ插入到改进型植物RNAi基础载体pF-GC5941M的启动子与间隔区、间隔区与终止子之间,形成11366bp的重组载体pFGC5941M-BF3′HI（简称为pBF3′HI）,复合PCR鉴定后转化根癌农杆菌,获得工程菌株。结果：载体构建成功。结论：构建了RNAi载体pBF3′HI,可用于芸薹属植物花色、种皮色泽、茎叶色彩等性状的机理研究和遗传修饰。     

NF-κB决定小鼠胎肝激酶-1基因启动子的基本活性

为克隆小鼠胎肝激酶-1（fetal liver kinase-1,FLK-1）基因上游启动子序列,并观察其不同截短片段在小鼠血管内皮细胞中的启动子活性,以小鼠全基因组为模板,通过PCR扩增方法获得-258～+299 bp、-96～+299 bp、-71～+299 bp、-36～+299 bp大小的FLK-1启动子片段,将其定向克隆入pGL3 Basic,构建荧光素酶报告基因载体,并制备NF -κB结合位点的突变或缺失体.在阳离子脂质体介导下,报告基因载体瞬时转染小鼠血管内皮细胞株SVEC 4-10.结果发现,在小鼠血管内皮细胞中,各FLK-1启动子片段均有活性;－71～－36 bp区存在FLK-1启动子的核心调控元件.针对该区域NF-κB结合位点进行突变或缺失,能导致启动子活性显著降低;凝胶电泳迁移率实验表明该区段能结合转录因子NF-κB.结果提示,成功克隆了在血管内皮细胞中具有活性的FLK-1上游启动子序列,NF-κB是决定其基本活性的重要转录因子,为进一步研究FLK-1基因的转录调控机制奠定了基础.     

黄连对羟基苯基丙酮酸双加氧酶基因的植物表达载体构建

目的:构建除草剂抗性基因黄连对羟基苯基丙酮酸双加氧酶的植物表达载体.方法:通过PCR从重组质粒pGWB2/Cjhppd中扩增出大小为1 300bp的目的片段,亚克隆到pGEM-T easy上.BamHⅠ和SpeⅠ双酶切pGEM-T Easy/Cjhppd和质粒pCambia1301,回收得到1 300bp的Cjhppd基因片段和开环质粒pCambia-1301-UbiN,用T4连接酶连接,得到重组质粒,利用三亲法将其导入农杆菌EHA105 中.结果:成功得到农杆菌EHA105的阳性菌落,菌落PCR扩增得到和预期大小一致的1 300bpDNA片段.结论:成功将具有除草剂抗性的Cjhppd构建到了含有玉米泛素启动子Ubi和选择性标记基因Hpt的植物表达载体pCambia-1301-UbiN/Cjhppd,并导入根癌农杆菌EHA105中,可以用于水稻等单子叶植物的遗传转化.