卵巢运输温度及卵母细胞促成熟因子对山羊卵母细胞体外成熟和体外受精的影响

探讨山羊卵母细胞体外成熟培养的影响因素,为优化山羊体外受精程序奠定基础。比较从屠宰场采摘的山羊卵巢运输温度和体外培养促成熟因子对卵母细胞体外成熟培养和体外受精效果的影响。结果表明,在运输温度接近室温(25±2)℃时的卵母细胞成熟率显著高于接近体温(36±2)℃时的运输温度(成熟率分别为53.8%,35.0%,P0.01),两种运输温度的卵巢卵母细胞成熟培养后体外受精率无显著差异(分别为37.9%,36.6%,P0.05)。与在体外成熟基础培养液(M1:M199 media+1μg/mL E2+10μg/mL FSH+10μg/mL LH+20%EGS)中进行成熟培养相比,在基础培养液中仅添加20 ng/mL EGF(M2)和另外添加10%GFF(M3)进行体外成熟培养的卵母细胞成熟率均有明显提高,其中成熟率在M1为53.8%,极显著低于M2的69.5%和M3的72.6%,P0.01;M2和M3间差异不显著;卵母细胞成熟培养后体外受精率在三者间无明显差异分别为37.9%,39.5%和40.6%,P0.05。山羊体外受精时从屠宰场采摘的卵巢宜在室温条件下进行运输,在体外成熟培养体系中加入EGF和GFF均可有效促进山羊卵母细胞的体外成熟,但EGF起关键作用。     

兔骨形态发生蛋白15 cDNA部分序列的克隆及其在卵母细胞中的表达

采用RT-PCR法从新西兰大白兔卵巢中克隆出BMP15基因部分cDNA片段,经blast分析后,发现其与猪、牛、绵羊、山羊、人和小鼠的同源性达到了83%—90%。同时,利用实时荧光定量RT-PCR方法检测了BMP15mRNA在卵母细胞体外成熟培养过程中(IVM)的表达变化情况,结果表明:在兔卵母细胞体外成熟过程中,该基因在未成熟卵母细胞中表达水平较低,在培养16h其表达丰度达到峰值,并与卵丘扩展时间相一致,随后下降,推测BMP15可能在兔卵丘细胞扩展中发挥重要作用。     

绵羊卵母细胞的体外培养、受精与发育的观察

笔者等把屠宰母羊卵巢卵母细胞经体外培养成熟后用于体外受精,曾得到76.2—92.5％的受精率。本实验将体外成熟、受精后的羊卵在体外条件下继续培养或者在2—4细胞期移植给受体母羊之后,分别观察了培养卵的发育情况和移植羊的受胎率。     

绵羊体外受精卵的发育及冷冻保存的研究

本研究主要探讨了绵羊体外受精卵在不同培养条件下的发育能力,并对体外发育至桑椹胚或囊胚的体外受精胚进行了冷冻保存。 从采自屠宰场的绵羊卵巢中采集卵母细胞,用含有10％FCS(或NSS)、hCG、E_2和Hepes的M199培养24—26小时,再以用IonophoreA23187诱导获能的新鲜精子进行授     

屠宰母牛卵巢卵母细胞的体外受精与发育的研究

为了开发良种母牛早期胚的人工生产技术,笔者等从当地屠宰场共采集了2526个卵巢,回收11420枚牛卵母细胞用于体外受精。方法是把从屠宰场采集的卵巢在1—16小时内带回实验室,用装有18号针头的注射器抽取2—5mm小卵泡中的卵母细胞,并选取卵     

牛体外受精卵在两种共同培养系统中发育的研究

为了使牛体外受精卵能通过体外早期发育阻滞期,我们建立了卵丘细胞单层(A)和输卵管上皮单层(B)两种共同培养系统。A1共同培养实验是在本实验室进行的,A2和B共同培养实验均在日本岗山大学农学部动物繁殖学研究室进行,牛输卵管组织的分离使用0.76％EDTA—PBS溶液,共同培养系统均使用含10％小牛血清的TCM—199(Earle's salts)作为培养液。培养的卵泡卵母细胞体外成熟率为100％,体外受精率为99—100％。在A1共同培养实验中,越过阻滞期发育到16—细胞以上的胚胎占卵裂胚的35.7％,与A2共同培养实验中越过阻滞期的发育率(40.1％)无显著差异(P<0.05)。A1和A2共同培养实验,在卵裂基础上得到的桑椹胚和囊胚发育率分别为23.7％和27.9％。每百枚培养的卵母细胞,在A1共同培养实验中可获得桑椹胚和囊胚15.1枚,在A2共同培养实验中可获桑椹胚和囊胚的20.5枚。B共同培养实验中桑椹胚和囊胚发育率为54.1％,显著高于A1或A2共同培养实验的相应发育率(P<0.001),使用B共同培养系统每百枚培养的卵母细胞可以获得37枚桑椹胚和囊胚。     

小鼠卵巢冷冻移植后卵泡发育和卵母细胞成熟的研究

本研究探讨了冷冻保存的1日龄小鼠卵巢异体异位移植后,其原始卵泡重新启动生长发育的能力。一日龄B6C2F．小鼠卵巢分离冷冻后置液氮中保存,保存1周。6个月后解冻,并将卵巢移植到8-12周龄B6C2F．受体鼠。肾脏包膜下,移植至少14d。每侧肾囊移植2枚卵巢的40只受体鼠中卵巢的回收率为45．00％（72／160）,而每侧。肾囊移植l枚卵巢的20只受体鼠的回收率为82．50％（33／40）。移植卵巢上卵泡的发育基本与体外自然生长鼠的卵巢卵泡发育情况一致。对卵巢移植19d的受体鼠用孕马血清促性腺激素（pregnant mare serum gonadotrophin,PMSG）处理后,从移植卵巢上发育成熟卵泡中获得的卵母细胞在MEM0c培养基中培养16-17h,有40．90％的卵母细胞发生生发泡破裂（germinal vesicle breakdown,GVBD）,其中89．02％的卵母细胞发育到第二次减数分裂中期（metaphaseⅡ,MⅡ）。将剩余的卵母细胞继续培养到20～21h,又有50．83％的卵母细胞发生生发泡破裂,但其中只有21．40％的卵母细胞能够发育到MII期。以上结果说明,小鼠早期卵巢经过冷冻．解冻并异体异位移植后,其原始卵泡能够重新启动生长发育,发育后的卵泡卵母细胞能够在体外培养成熟。这些结果意味着原始卵泡或卵巢冷冻一移植技术有可能充分利用雌性生殖细胞用于濒危动物保种、建立动物基因库和人类辅助生殖等。     

有关卵原细胞在卵泡中形成卵母细胞的4点释疑

浙科版选修3在《胚胎工程》中指出,从卵巢中采集到的是未成熟的卵母细胞,并且要将其培养至成熟才具受精能力,这与必修2中有关卵原细胞形成卵细胞的认知存在一定冲突.本文从生理学的角度对卵原细胞的形成、卵泡的发育、卵母细胞的去向及体外培养4个方面进行释疑.     

屠宰绵羊卵巢卵母细胞的体外培养成熟

[目的] 探索把屠宰母羊卵巢卵母细胞在体外条件下培养成熟的有效处理方法和条件以便为体外受精技术的研究提供更多的成熟卵子。 [方法] 把从屠宰母羊新鲜卵巢的发育卵泡中采集的784枚卵母细胞分为3种类型,即A型(卵丘细胞层较完整的卵子)、B型(卵丘细胞层部分脱落的卵子)和C型(卵丘细胞、放射冠均脱落的裸卵)。并     

体外培养小鼠卵母细胞及其生长分化因子-9基因表达

体外培养小鼠的窦前卵泡以得到第二次减数分裂中期(MⅡ)卵母细胞,比较体外发育卵母细胞与体内生长的卵母细胞生长分化因子-9(GDF-9)的基因表达量,探讨GDF-9的表达对卵母细胞体外发育成熟的影响。选择体外培养第2天(D2)、D4、D6、D8、D10、D12卵母细胞作为体外发育组;同窝雌性小鼠出生后D12、D14、D16、D18、D20、D22卵母细胞作为体内发育组;半定量逆转录多聚酶链反应技术分别检测两组MⅠ卵母细胞GDF-9基因表达量。结果体外培养小鼠窦前卵泡可以得到MⅡ期卵母细胞,卵泡成活率、窦腔形成率、卵母细胞成熟率分别达到89·5%、51·8%和56·6%。小鼠卵母细胞GDF-9基因表达量随发育时间的改变而发生变化,而体外发育D8—12卵母细胞GDF-9表达量显著低于同期体内发育卵母细胞(P<0·05)。体外发育D8—12卵母细胞GDF-9基因表达量低于同期体内发育的卵母细胞的原因之一可能是其发育潜能较低。     

体外培养小鼠卵母细胞及其生长分化因子-9基因表达

体外培养小鼠的窦前卵泡以得到第二次减数分裂中期(MⅡ)卵母细胞，比较体外发育卵母细胞与体内生长的卵母细胞生长分化因子-9(GDF-9)的基因表达量，探讨GDF-9的表达对卵母细胞体外发育成熟的影响。选择体外培养第2天(D2)、D4、D6、D8、D10、D12卵母细胞作为体外发育组；同窝雌性小鼠出生后D12、D14、D16、D18、D20、D22卵母细胞作为体内发育组；半定量逆转录多聚酶链反应技术分别检测两组MⅠ卵母细胞GDF-9基因表达量。结果体外培养小鼠窦前卵泡可以得到MⅡ期卵母细胞，卵泡成活率、窦腔形成率、卵母细胞成熟率分别达到89.5%、51.8%和56.6%。小鼠卵母细胞GDF-9基因表达量随发育时间的改变而发生变化，而体外发育D8—12卵母细胞GDF-9表达量显著低于同期体内发育卵母细胞(P<0.05)。体外发育D8—12卵母细胞GDF-9基因表达量低于同期体内发育的卵母细胞的原因之一可能是其发育潜能较低。     

兔骨形态发生蛋白15 cDNA部分序列的克隆及其在卵母细胞中的表达(英文）

采用RT-PCR法从新西兰大白兔卵巢中克隆出BMP15基因部分cDNA片段,经blast分析后,发现其与猪、牛、绵羊、山羊、人和小鼠的同源性达到了83%—90%。同时,利用实时荧光定量RT-PCR方法检测了BMP15 mRNA在卵母细胞体外成熟培养过程中（IVM）的表达变化情况,结果表明：在兔卵母细胞体外成熟过程中,该基因在未成熟卵母细胞中表达水平较低,在培养16 h其表达丰度达到峰值,并与卵丘扩展时间相一致,随后下降,推测BMP15可能在兔卵丘细胞扩展中发挥重要作用。     

斑马鱼卵母细胞的体外成熟及成熟卵的受精发育

采用体外培养的方法,研究斑马鱼卵母细胞的成熟过程。Ⅳ时相初级卵母细胞在o．5μg／m1 17a－羟基孕酮的EM－199培养液中,80％氧气,25℃的体外培养条件下,在40min内,胚泡(GV)逐渐由卵母细胞中央至动物极边缘l／2处移到动物极边缘,进八V时相卵母细胞。30min后胚泡破裂(GVBD),胚泡破裂率为59％。此种卵母细胞继续培养2h才完全成熟。成熟卵不能从滤泡膜中自然排出。冷开水中剥离其外边的滤泡膜后加入具有受精能力的精子,即能使成熟卵受精,受精膜举起,胚盘在动物极形成。其后受精卵的分裂、发育等与自然成熟受精卵相同。以发育至囊胚为受精标准,这种体外成熟卵受精率为78％。这是斑马鱼卵母细胞体外培养成熟的首例报道。鱼类卵母细胞体外成熟技术的建立,为外源基因卵母细胞胚泡内转移奠定了基础。     

人重组卵泡刺激素和表皮生长因子对性未成熟小鼠卵母细胞和颗粒细胞复合体体外发育的作用(英文)

卵泡刺激素(FSH)对有腔卵泡和排卵前卵泡的促生长作用已被普遍接受,但关于其对腔前卵泡发育的作用报道结果不尽相同。关于表皮生长因子(EGF)对腔前卵泡的作用尚不确切。本研究目的在于探讨人重组卵泡刺激素(rechFSH)和EGF对早期卵泡发育的作用。利用胶原酶消化法从12日龄的小鼠卵巢中分离得到卵母细胞-颗粒细胞复合体(OGCs)(Fig.1)。体外每孔30~40个培养物并分别添加胎牛血清(FBS)、rechFSH和EGF。培养物每4天测量卵母细胞和OGCs直径,并每天照相。结果显示rechFSH显著促进小鼠OGCs及其卵母细胞的体外发育,这一作用可被EGF进一步增强(p<0.05)(Fig.2)。但到第八天培养结束时,培养后的OGCs卵母细胞要显著小于体内同期生长对照组(p<0.05)(Fig.3)。说明FSH和EGF在卵泡早期发育中起重要作用。     

银鲫卵母细胞体外诱导成熟技术的建立

研究以银鲫为材料, 根据银鲫(Carassius auratus gibelio)卵母细胞生发泡(Germinal vesicle, GV)边移程度及剥离GV中减数分裂前期染色体的凝集状态, 将银鲫Ⅳ时相的卵母细胞分为GV0、GV1、GV2和GV3四个时期; 并进一步比较了分别处于这4个时期银鲫卵母细胞体外诱导培养的成熟率、卵裂率和孵化率。结果表明, GV1期之后的卵母细胞均可有效进行体外诱导成熟, 可正常受精发育, 由于GV1期卵母细胞有较长时间用于显微操作, 因此GV1期卵母细胞被选为进行体外诱导的最早时期的卵母细胞。以GV1期卵母细胞为研究材料, 摸索了银鲫卵母细胞体外诱导成熟的适宜条件: 取GV1期的Ⅳ时相卵母细胞, 放置于pH 8.5、加有1 μg/mL孕酮激素(17α, 20β-dihydroxy-4-pregnen-3-one, DHP)的格氏平衡盐溶液(Gey’s balanced salt solution, GBSS)中, 在23℃培养箱中体外诱导12h后, 将滤泡膜剥离后再进行人工体外授精, 其所获胚胎的孵化率可达55.5%。此外, 将体外转录合成的带GFP标签的h2af1o mRNA注射到GV1期卵母细胞, 发现经显微操作和体外诱导后不仅可以通过GFP绿色荧光信号活体观察GVBD、受精、卵裂和早期胚胎发育的全过程, 而且诱导成熟的卵子仍可正常受精和胚胎发育。研究建立的银鲫卵母细胞体外诱导成熟技术为银鲫和其他鱼类卵母细胞发育过程研究及其相关基因和细胞显微操作提供了技术平台。     

牛卵母细胞体外受精及体外发育的研究

本研究利用从屠宰场收集到的牛卵巢,获取卵母细胞,经体外成熟后进行体外受精,其受精率为73±2％。受精卵分别用发育培养基TCM—199+10％FCS(MA)、颗粒细胞单层(MB)和卵管上皮单层(MC)进行培养,其8—16细胞的发育率分别为52％、54％和61％;而囊胚的发育率分别为20％、28％和42％。相比较而言,MB和MC培养基内突破8—16细胞阻断发育到囊胚的发育率优于MA。     

雄性受体小鼠性腺对移植卵巢卵母细胞生长发育的影响

目的探索雄性受体性腺对移植卵巢卵母细胞生长发育的影响。方法将1日龄小鼠卵巢移植入成年雄鼠肾囊下,将雄性受体小鼠分为性腺摘除组和性腺在位组,于21d回收移植卵巢,以评价雄性小鼠性腺对新生小鼠卵巢移植体卵母细胞生长发育的影响。结果移植后21d,性腺摘除组和性腺在位组卵巢回收率分别为80.0%和92.9%,移植体生长增大;每个卵巢平均回收卵母细胞数分别为(30.4±4.3)和(42.4±11.1)个,两者差异不显著(P0.05);性腺摘除组回收的均为GV期卵母细胞,性腺在位组大部分为GV期卵母细胞,有的达到MII期。结论雄性受体小鼠能够支持移植卵巢卵母细胞的生长发育,雄性受体的性腺对其影响不明显。     

一氧化氮供体硝普纳对小鼠卵母细胞体外自发成熟的影响

目的　探讨一氧化氮供体—硝普纳 (SodiumNitroprusside ,SNP)对昆明小鼠卵母细胞体外自发成熟的影响。方法　利用体外培养方法 ,在培养的不同时间观察卵母细胞的成熟情况 ,研究SNP对卵母细胞自发成熟的动力学影响。结果　 (1) 1mmol LSNP能够明显延迟卵丘卵母细胞复合体 (CEOs)的自发成熟 ,与对照组相比 ,CEOs的生发泡破裂 (GVBD)和第一极体 (PB1)释放分别延迟了 8h和 10h。但在培养结束 (2 4h)时 ,CEOs处理组的PB1释放率与对照组相比有明显的降低 ,而处理组的生发泡破裂 (GVBD)百分率和对照组相比没有明显变化 ;1mmol LSNP能够明显延迟裸卵母细胞 (DOs)的自发成熟 ,与对照组相比 ,DOs处理组的GVBD和PB1释放分别延迟了 6h和 12h。且在培养 2 4h后 ,DOs处理组的GVBD和PB1释放率与对照组相比有显著的降低。 (2 ) 1mmol LSNP能够明显促进CEOs中卵丘细胞的离散 ,造成CEOs互相粘连在一起。 (3) 1mmol LSNP能够明显影响体外培养的DOs的形态 ,但对CEOs的卵母细胞却没有影响。而 1μmol LSNP对CEOs和DOs的自发成熟都没有影响。 结论高浓度的SNP对小鼠卵母细胞体外自发成熟有抑制作用     

前培养对猪卵母细胞生发泡染色质构型和体外成熟的影响

在体外成熟培养时使卵母细胞过早接触高浓度激素可能影响体外成熟卵母细胞的质量。本实验研究了推迟卵母细胞与激素接触时间对卵母细胞GV染色质构型、卵母细胞核成熟质量及极体形态的影响。结果表明：猪体外成熟卵母细胞的极体形态不同,分为完整、退化、碎裂和无极体四种。在不含激素培养液中前培养12h,A类卵母细胞的GV-1比例(48．2％)明显高于在含激素培养液中前培养12h卵母细胞(27．1％);而前者的GV-3比例(19．6％)却明显低于后者(50．8％);前者成熟卵母细胞的极体完整率(59．6％)也明显高于后者(27．5％)。这说明推迟卵母细胞与激素接触时间可能提高体外成熟卵母细胞的质量和发育同步水平。     

绵羊体外受精卵的体外发育及冷冻保存研究

将体外成熟、体外受精的绵羊卵子,在体外培养至桑椹胚—襄胚期并进行冷冻保存,观察了培养卵的体外发育和冷冻保存效果。从采自屠宰场的绵羊卵巢中抽取卵母细胞,用含有10％FCS(或NSS)、HCG、E_2和Hepes的M199培养24—26小时,再以经Ionophore A23187诱导获能的新鲜精子进行授精。授精后6—8小时移入发育用培养基内进行培养,发育用培养基为含有10％FCS(或NSS)、丙酮酸钠、Hepes的M 199。授精72小时后,FCS组和NSS组的卵裂率分别为36.9％和45.2％,后者显著高于前者。继续培养7—10天后,桑椹胚～囊胚的发育率分别为11.6％和23.4％,两者间差异极显著。将桑椹胚和囊胚冷冻保存于PBS+20％FCS+10％乙二醇冷冻液内,解冻后的胚胎形态正常率分别为82.0％和71.9％。