稻瘟病菌微波诱发突变体的分析*

通过诱变获得突变体是研究稻瘟病菌变异机制的基础。本文用微波炉对稻瘟病菌分生孢子进行低强度短时间处理获得了一批形态发育和致病性突变体,并对它们进行了分析。突变体1-40-271菌落呈白色,产孢与萌发均正常,但萌发后即便在人工疏水表面上也不能形成附着胞,且丧失了致病性;突变体2-20-6菌落呈黄色,孢子萌发率为1%,萌发的孢子其附着胞形成率仅为0.01%,致病性减弱;突变体2-30-3菌落呈黄色,形成的附着胞大部分不正常,但致病性正常。Rep-PCR指纹分析发现,突变体2-20-6和2-30-3比其相应野生型少1条带,而突变体1-40-271与其野生型比较没有变化,说明微波可能造成稻瘟病菌基因组DNA缺失或点突变而发生变异。继代分析表明微波处理获得的稻瘟病菌形态和致病性突变体是稳定的。     

Ca^2＋信号途径参与稻瘟病菌分生孢子萌发及附着胞形成的调控

为了确定Ca^2 信号途径是否参与、在哪一时期参与稻瘟病菌分生孢子萌发及附着胞形成过程的调控,用四种可从不同位点阻断 Ca^2 信号途径的抑制剂分别处理分生孢子,观察抑制剂对孢子萌发及附着胞形成过程的抑制作用。结果表明：Ca^2 螯合剂 EGTA、Ca^2 通道抑制剂 Verapamil、抑制磷脂酶 C 活性的抑制剂 U-73122、影响钙调素与钙调素依赖蛋白激酶作用位点的抑制剂 KN-93,随着浓度的增加,对孢子萌发和附着胞形成过程的抑制作用明显增强;同一浓度下,抑制剂对附着胞形成过程的抑制作用大于孢子萌发过程;抑制剂影响孢子萌发和附着胞形成过程在萌发早期(1-4h)最有效;在完全被抑制、不能萌发的孢子内出现了许多颗粒状囊泡;抑制剂可使附着胞形态明显变小甚至不能形成。以上结果表明钙信号途径参与了稻瘟病菌孢子萌发及疏水条件下附着胞形成过程的调控。     

稻瘟病菌T-DNA插入方法优化及其突变体分析

优化了农杆菌介导转化稻瘟病菌获得T-DNA插入突变的条件,包括选择转化子的潮霉素B用量,抑制农杆菌的抗生素头孢噻肟钠和羧苄青霉素的配比,不同转化阶段培养基的选择等。转化1×10⁶个孢子平均可获得约500个左右的转化子,PCR和TAILPCR检测表明约85%转化子中含T-DNA插入。对1520个突变体进行形态变异观察,发现菌落颜色突变的有15个;随机取58个突变体进行比较,发现产孢量减少的4个,孢子萌发率降低的8个,附着胞形成率降低的9个;还获得对水稻品种C101LAC（Pi-1）和751127（Pi-9）致病的突变体,为进一步克隆相应的无毒基因奠定了基础。     

Ca2+信号途径参与稻瘟病菌分生孢子萌发及附着胞形成的调控

为了确定Ca2+信号途径是否参与、在哪一时期参与稻瘟病菌分生孢子萌发及附着胞形成过程的调控,用四种可从不同位点阻断Ca2+信号途径的抑制剂分别处理分生孢子,观察抑制剂对孢子萌发及附着胞形成过程的抑制作用.结果表明Ca2+螯合剂EGTA、Ca2+通道抑制剂Verapamil、抑制磷脂酶C活性的抑制剂U-73122、影响钙调素与钙调素依赖蛋白激酶作用位点的抑制剂KN-93,随着浓度的增加,对孢子萌发和附着胞形成过程的抑制作用明显增强;同一浓度下,抑制剂对附着胞形成过程的抑制作用大于孢子萌发过程;抑制剂影响孢子萌发和附着胞形成过程在萌发早期(1～4h)最有效;在完全被抑制、不能萌发的孢子内出现了许多颗粒状囊泡;抑制剂可使附着胞形态明显变小甚至不能形成.以上结果表明钙信号途径参与了稻瘟病菌孢子萌发及疏水条件下附着胞形成过程的调控.     

稻瘟菌MgORP1基因敲除突变株的构建及其表型分析

[目的]了解稻瘟病菌中氧固醇结合蛋白(oxysterol-binding proteins related proteins,缩写为ORPs)家族成员组成情况,构建MgORP1基因缺失突变株和互补株,对MgORP1基因功能进行初步研究.[方法]以ORPs家族的典型结构域"ORD"为靶标,对稻瘟病菌基因组数据库进行BlastP搜索.通过同源重组的策略,构建MgORP1基因缺失突变体,再通过重新导入该基因全长片段获得互补株.然后对野生型、突变体和互补株进行菌落、分生孢子和附着胞形态或形成情况、以及致病力进行比较分析.[结果]稻瘟病菌基因组中含有6个可能的ORPs族蛋白,其中MgORP1基因的破坏降低了稻瘟菌在完全培养基上的菌落生长速率和产孢量.但对菌丝、分生孢子和附着胞的形态,以及在水稻上的致病力没有明显影响.[结论]MgORP1基因可能与稻瘟病菌的菌落生长和产孢量相关.     

Ca2+信号途径参与稻瘟病菌分生孢子萌发及附着胞形成的调控

为了确定Ca²⁺信号途径是否参与、在哪一时期参与稻瘟病菌分生孢子萌发及附着胞形成过程的调控,用四种可从不同位点阻断Ca²⁺信号途径的抑制剂分别处理分生孢子,观察抑制剂对孢子萌发及附着胞形成过程的抑制作用。结果表明:Ca²⁺螯合剂EGTA、Ca²⁺通道抑制剂Verapamil、抑制磷脂酶C活性的抑制剂U-73122、影响钙调素与钙调素依赖蛋白激酶作用位点的抑制剂KN-93,随着浓度的增加,对孢子萌发和附着胞形成过程的抑制作用明显增强;同一浓度下,抑制剂对附着胞形成过程的抑制作用大于孢子萌发过程;抑制剂影响孢子萌发和附着胞形成过程在萌发早期(1~4h)最有效;在完全被抑制、不能萌发的孢子内出现了许多颗粒状囊泡;抑制剂可使附着胞形态明显变小甚至不能形成。以上结果表明钙信号途径参与了稻瘟病菌孢子萌发及疏水条件下附着胞形成过程的调控。     

过氧化物酶体增殖剂对稻瘟病菌生长发育及致病性的影响

【目的】探索过氧化物酶体增殖剂(Peroxisome proliferators,PPs)对稻瘟病菌生长发育及致病性的影响。【方法】在6种不同的PPs诱导下,观察比较稻瘟病菌过氧化物酶体数量及相关基因表达、生长速率、孢子萌发、附着胞形成与致病性的差异。【结果】在不同的PPs诱导下,稻瘟病菌过氧化物酶体数量均呈现明显的增加,同时过氧化物酶体形成相关基因PEX8、PEX11、PEX14的表达量升高;PPs影响病菌菌丝生长、分生孢子萌发及附着孢形成,并导致致病性的减弱。其中,2,4-D与阿司匹林的抑制效果最为显著。同时,2,4-D与ASA对稻瘟病菌过氧化物酶体形成突变体Δpex5和Δpex7的生长抑制效果与野生菌株相比明显增加。【结论】首次将PPs类化合物用于模式丝状病原真菌稻瘟病菌的研究。研究发现6种PPs均能够引起过氧化物酶体的增殖,并可抑制稻瘟病菌生长发育,降低致病性。     

CfAtg8在调控果生刺盘孢正负菌株分化中的功能

由果生刺盘孢Colletotrichum fructicola引起的炭疽叶枯病严重危害苹果果实和叶片。刺盘孢属真菌可以产生具有形态和遗传差异的正型(+)和负型(-)菌株,但其分化的分子机制目前尚不清楚。本研究通过同源重组对CfAtg8功能进行分析,结果显示,CfAtg8显著影响果生刺盘孢正菌株(1104-7)菌落颜色和气生菌丝茂密程度,但不影响负菌株(1104-6);正菌株突变体不产生子囊壳,负菌株突变体子囊壳变小、数量增多;正菌株突变体与负菌株野生型1104-6杂交不形成交配线,负菌株突变体与正菌株野生型1104-7杂交形成正常交配线;此外,CfAtg8还影响正、负菌株分生孢子萌发、附着胞形成及致病性等。这些结果表明自噬基因CfAtg8是影响果生刺盘孢正负菌株分化、形态发育和致病的重要基因。     

胶孢炭疽菌C2H2型转录因子CgGcp1的生物学功能

【背景】胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)可以寄生于多种植物,侵染方式多样,能够引起严重的农业危害。在胶孢炭疽菌中,CgGcp1是一个C2H2型的转录因子,关于其生物学功能的研究未见报道。【目的】明确CgGcp1的生物学功能,为深入解析该病菌的致病机制奠定一定的理论依据。【方法】构建CgGCP1基因的敲除载体,利用同源重组得到敲除突变体。通过表型分析,包括营养生长、胁迫响应、孢子产生、附着胞形成及致病性分析等,明确该基因的生物学功能。【结果】CgGCP1基因敲除突变体生长速率较野生型减慢,对SDS、刚果红、NaCl和甘油更加敏感,孢子产量显著降低,附着胞的形成率降低且侵入能力减弱,在橡胶叶片上的致病力明显下降。【结论】CgGcp1参与调控胶孢炭疽菌营养生长、细胞壁完整性、分生孢子产生、附着胞形成与侵入和致病性。     

禾谷镰刀菌中FgPDE1基因的敲除及其功能的研究

目的:旨在敲除禾谷镰刀菌Fusarium graminearum Fg PDE1基因,确定其缺失突变体表型,从而分析该基因的生物学功能。方法:应用Split-marker技术构建含有潮霉素基因敲除盒,通过PEG介导原生质体转化,PCR筛查抗潮霉素转化子以获得缺失突变体ΔFg PDE1,根据突变体表型变化及致病性的检测对Fg PDE1基因的功能进行分析。结果:采用Split-marker技术,成功构建了Fg PDE1基因敲除盒;PEG介导转化禾谷镰刀菌原生质体后成功获得转化子。经PCR筛查,得到3个PCR确认的敲除突变体;表型观察发现,ΔFg PDE1菌落的外型及菌落生长速度与野生型没有明显差异。孢子侵染西红柿果实实验证明:以西红柿为侵染宿主,相对于野生型,突变体致病性没有明显减弱;但突变体分生孢子产量显著下降。结论:Fg PDE1基因可能与禾谷镰刀菌分生孢子的形成有关。     

尖镰孢古巴专化型Focr4-1701突变体的生物学表型研究

由尖镰孢古巴专化型(Fusarium oxysporum f.sp.cubense,Foc)引起的香蕉枯萎病是香蕉生产中的毁灭性病害之一。Foc有4个小种,其中4号小种(Focr4)因其寄主范围广且无高抗病性的香蕉品种,对香蕉产业的危害最大,其致病机制至今尚不清楚。为研究其致病机制,本文对Focr4野生型菌株(Focr4-193-6)、因其T-DNA插入导致致病性严重减弱的突变体Focr4-1701、T-DNA插入标签基因敲除子△Focr4-1701及敲除基因互补子△Focr4-1701-cp-1为材料,从致病性测定、玻璃纸穿透试验、孢子形态观察、产孢量与孢子萌发率测定、粗毒素测定等方面对其与致病性相关的生物学表型进行了测定。结果表明:T-DNA插入突变体Focr4-1701和基因敲除突变体△Focr4-1701接种后的香蕉植株叶片没有表现发病症状,敲除基因互补菌株与野生型菌株一样表现出发病症状;T-DNA插入突变体和基因敲除突变体不能穿透玻璃纸生长,T-DNA插入突变体及基因敲除突变体在产孢量、孢子萌发率和产毒素能力上均极显著低于野生型菌株及互补菌株。这些表型性状差异说明Focr4-1701致病性严重减弱可能是T-DNA插入位点标签基因失活后导致了菌丝体侵染能力下降及产毒素能力降低造成的。     

稻瘟病菌稻巨座壳存活因子基因MoSVF1的功能分析

稻巨座壳引起的稻瘟病是一种重要的农作物真菌病害,该病害的发生和流行限制了水稻的产量,威胁全球粮食安全。细胞凋亡和自噬在稻巨座壳的致病性中起重要作用,抗细胞凋亡的存活因子Svf1在禾谷镰刀菌和核盘菌中被报道与致病力相关,但是其在稻巨座壳中的详细功能却并未见报道。本研究对MoSvf1进行序列分析,发现Svf1在真菌中高度保守。对其进行基因敲除并观察表型,发现Mosvf1突变体菌落生长减慢,菌丝形态异常,但其产孢量相比野生型有显著性增多。说明MoSvf1正调控稻巨座壳的营养生长,负调控孢子的形成。Mosvf1突变体的附着胞形成和致病力无可见缺陷。为进一步完善MoSvf1的互作调控网络,我们通过IP-MS的方法鉴定MoSvf1的互作蛋白,发现其中包含多个与胞内信号传导及细胞凋亡有关的蛋白。对MoSvf1互作蛋白的分析有助于进一步揭示MoSvf1的调控模式和作用途径,为阐明稻巨座壳的生长和凋亡打下重要基础。     

稻曲病菌PMK1类同源基因克隆及在稻瘟病菌遗传互补中的功能验证

[目的]克隆稻曲病菌PMK1类MAPK(Mitogen-activated protein kinase)同源基因.[方法]根据丝状真菌MAPK蛋白保守性设计简并引物扩增稻曲病菌MAPK基因部分片段,进而利用TAIL-PCR进行染色体步移和RT-PCR获得UVMK1基因全长和cDNA全长.构建互补载体,交叉互补稻瘟病菌APMK1突变体菌株nn78进行功能验证,包括附着胞分化和致病性测定.[结果]UVMK1基因全长1435 bp,包含3个内含子,编码355氨基酸的蛋白.UVMK1推导蛋白与丝状真菌Magnaporthe grisea PMK1,Fusarium oxysporum FMK1,Fusarium solani FSMAPK,Colletotrichumlagenarium CMK1,Botrytis cinerea BMK1,Claviceps purpurea CMPK1等编码蛋白高度同源.转化稻瘟病菌菌株nn78,获得5个转化子.其中选取的转化子恢复了稻瘟病菌正常的附着胞分化和对大麦叶片的致病能力.[结论]本研究成功分离了首个稻曲病菌MAPK基因,而且UVMK1基因是稻瘟病菌PMK1的同源基因.     

果生刺盘孢侵染苹果致病关键基因Cfcyp450的功能

果生刺盘孢Colletotrichum fructicola能够引起苹果炭疽叶枯病和苹果苦腐病。前期通过基因组分析发现一个叶枯型C. fructicola菌株特异基因Cfcyp450。本研究对其功能进行分析,以明确其在致病中的作用。采用同源重组方法获得了敲除突变体。表型分析显示,Cfcyp450敲除突变体与野生型生长速率无明显差别,但敲除突变体菌落变白;与野生型相比,突变体附着胞形成降低30.02%;侵染钉延伸菌丝对玻璃纸的穿透率下降41.19%。致病性测定显示,突变体对嘎啦叶片致病力显著下降。生物信息学分析显示,Cfcyp450仅存在于叶枯型菌株中,同时与烟草和拟南芥内生菌同源性较高,但与刺盘孢属物种亲缘关系较远。这些结果表明果生刺盘孢Cfcyp450基因为叶枯型菌株的关键致病因子,可能通过水平转移获得。     

落叶型大丽轮枝菌T-DNA插入突变体库的构建

采用ATMT技术建立大丽轮枝菌落叶型菌株XJ2008菌株的T-DNA插入突变体文库,共获得6 043个突变体。从中随机挑选104个突变体,以野生型XJ2008菌株为参照,评价其致病性、菌落生长速率、分生孢子及微菌核的产生能力等。结果表明,有12.5%的突变体丧失产孢能力,4.8%的突变体的生长速率显著减慢,8.7%的突变体的生长速率显著加快,12.5%的突变体丧失产生微菌核的能力,47.1%的突变体的致病性显著低于野生型菌株XJ2008,且突变体2-736、2-740、2-745的病情指数分别约为野生型菌株XJ2008的0.184、0.168和0.197倍。该突变体库突变体遗传稳定性好,性状多样性丰富。     

金龟子绿僵菌附着胞分化及其与环腺苷酸cAMP的关联性研究

寄主识别与附着胞分化是虫生真菌启动侵染过程的首要步骤。本文利用先前获得的金龟子绿僵菌基因缺失突变株与其野生型一起进行附着胞分化研究。接种后不同时间下的观察表明,绿僵菌突变株或野生型的附着胞既可以在萌发不久的芽管顶端形成,也可以在伸长菌丝分支的顶端形成。与野生型不同的是,突变株附着胞的分化频率显著下降,附着胞周围也缺乏粘液层的产生。研究表明,绿僵菌的类枯草杆菌类体壁降解酶对于附着胞分化不产生影响,对体壁降解也非完全必需的。与突变株附着胞分化频率显著降低相对应,其胞内环腺苷酸cAMP水平显著下降,而添加外源cAMP能够显著增加其附着胞分化频率,说明绿僵菌cAMP信号途径对于调控附着胞分化起着重要的作用。     

细弱绒泡菌的生活史

利用燕麦-琼脂培养、基物培养及扫描电镜技术研究了细弱绒泡菌的个体发育过程,在燕麦琼脂培养基上完成了从孢子到孢子的生活史。结果表明,细弱绒泡菌生活史包括单核的黏变形体或游动胞、多核的营养体原质团以及孢子形成阶段。孢子球形,表面具细小疣点。孢子萌发为裂式,释放1黏变形体。黏变形体行变形运动,在有水的条件下,可转变为游动胞。成熟原质团橘黄色。原质团类型为显型,具有扇形网络状菌脉。成熟原质团可形成多个孢囊。琼脂培养基上获得的细弱绒泡菌孢子与野生型相似,并具有可育性。     

尖角突脐孢菌在稗草和水稻上的萌发和侵染行为比较研究

本试验结合曲利苯兰和荧光素钠两种染色方法的优点,从显微角度研究了尖角突脐孢菌(Exserohilum monoceras)两个菌株X-27和HN-14在稗草和水稻上萌发和侵染行为的差异。结果表明,在寄主稗草上,接种4h后尖角突脐孢菌孢子开始从一端或两端萌发形成初生芽管;10h后芽管顶端膨大形成附着胞,附着在寄主表面,两端萌发的孢子约90%一端败育,仅一端形成成熟附着胞;在接种后24h内成熟附着胞形成率与接种时间成正相关,24h后趋于稳定;16h后在成熟附着胞下方受侵染的细胞内指状吸器开始形成,随后发育为掌状吸器;接种36h后菌丝在组织表面扩展形成网状,同时稗草叶片上显现叶斑病症状,部分菌丝能在细胞间蔓延扩展。在非寄主植物水稻上,同样观察到孢子萌发产生芽管,但是萌发起始时间滞后大约4h,初生菌丝分枝明显减少,且未能观察到附着胞和吸器的产生。     

黄柄钙皮菌的生活史

利用基物培养、燕麦-琼脂培养技术及扫描电镜技术研究了黄柄钙皮菌的个体发育过程,在燕麦琼脂培养基上完成了从孢子到孢子的生活史。结果表明,生活史包括单核的黏变形体或游动胞、多核的营养体原质团以及孢子形成阶段。孢子球形,表面具疣突。孢子萌发为裂式,释放1黏变形体。黏变形体行变形运动,在有水的条件下,可转变为游动胞并游动。可观察到1长具极性的鞭毛。合子形成原质团。成熟原质团棕色。原质团类型为显型,具有扇形网络状菌脉。琼脂培养基上获得的黄柄钙皮菌孢子与野生型相似,并具有可育性。     

稻瘟病菌致病性的分子遗传学研究进展

由稻瘟病菌引起的稻瘟病是水稻生产上危害最为严重的真菌病害,对世界粮食生产造成巨大损失。稻瘟病菌成功侵染寄主包括分生孢子萌发、附着胞形成、侵染钉分化和侵染性菌丝扩展等一系列错综复杂的过程,其中每一环节都是由特定基因控制的。稻瘟病菌与水稻的互作符合经典的基因对基因学说,二者的不亲和互作是无毒基因与抗病基因相互作用的结果。近几十年来,世界各国的科学家对稻瘟病菌致病性的生物学及其遗传的分子机制进行了深入的研究。文章就稻瘟病菌致病性的分子遗传学及其遗传变异机制的研究进行了综述,同时对功能基因的研究方法进行了总结。