共表达H5N1、H7N1亚型AIV HA与鸡IL-18多价重组鸡痘病毒免疫保护性研究

用本实验室构建的重组鸡痘病毒rFPV-H5HA-IL18、rFPV-H5HA-H7HA-IL18和rFPV-H5HA,经翼蹼免疫1日龄SPF鸡和7日龄商品Leghorn蛋鸡,同时以H5亚型AIV全病毒灭活疫苗作为对照.免疫后测定HI抗体效价、淋巴细胞转化指标、重组疫苗对增重的影响、免疫后的攻毒保护效力、免疫后的抑制排毒情况.免疫后不同时间分别测定特异性抗体和淋巴细胞刺激指数.试验结果表明,3株重组鸡痘病毒株均能诱导鸡体产生血凝抑制抗体(HI);共表达鸡IL-18的rFPV-H5HA-IL18和rFPV H5HA-H7HA-IL18诱导商品蛋鸡的细胞免疫水平明显高于非共表达鸡IL-18的rFPV-H5HA.重组鸡痘疫苗免疫SPF和商品蛋鸡后第21d进行攻毒实验,rFPV-H5HA-IL18和rFPV-H5HA-H7HA-IL18免疫攻毒保护率达10/10,rFPV-H5HA免疫攻毒保护率达9/10,与常规疫苗相当.免疫的商品蛋鸡于攻毒后7d采集泄殖腔棉试子样品,检测排毒情况.结果表明,rFPV-H5HA-IL18、rFPV-H5HA-H7HA-IL18免疫组在攻毒后第7d无排毒,其抑制免疫鸡排毒效果优于常规疫苗和单独表达HA的rFPV-H5HA重组鸡痘病毒.rFPV-H5HA-IL18和rFPV-H5HA-H7HA-IL18免疫组鸡,在14日龄时的体重明显高于rFPV-H5HA免疫组和常规疫苗对照免疫组,表明共表达的鸡IL-18能降低鸡痘病毒载体对雏鸡增重的影响.     

共表达H5亚型禽流感病毒HA和NA基因的重组鸡痘病毒及其免疫效力

为了构建更为安全有效地抵抗高致病性H5亚型禽流感病毒的基因工程疫苗,将H5亚型禽流感病毒分离株的血凝素(HA)基因和神经氨酸酶(NA)基因定向插入鸡痘病毒转移载体p11S中,H5A和NA基因的启动子分别为PS和PE/L,获得用不同的启动子启动不同的外源基因且两基因盒方向为背向串联的重组转移载体p11SH5ANA。将p11SH5ANA转染至已感染鸡痘病毒282E4疫苗株(wt-FPV)的鸡胚成纤维细胞(CEF)中。p11SH5ANA与wt-FPV基因组DNA之间的同源重组产生了重组鸡痘病毒rFPV-11SH5ANA。通过在含X-Gal的营养琼脂上连续挑选蓝色病毒蚀斑,获得纯化的重组病毒。经传代证实该重组病毒具有良好的遗传稳定性。用105PFU的rFPV-11SH5NA免疫无特定病原体(SPF)鸡,能激发机体产生有效的血凝抑制(HI)抗体。初步的动物试验表明,该重组病毒能使经肌肉注射攻毒的SPF鸡抵抗H5亚型AIV的致死性攻击,保护率为100%,显示出一定的应用前景。     

表达H5亚型禽流感病毒HA基因和鸡IL-18基因重组禽痘病毒的构建

[目的]获得共表达H5亚型AIV HA基因和鸡IL-18基因的重组禽痘病毒.[方法]将含痘病毒启动子LP2EP2的HA基因和鸡IL-18基因插入到禽痘病毒转移载体pSY681中,获得重组转移载体pSYHA/IL-18.用脂质体将其转染已感染亲本禽痘病毒S-FPV-017株的鸡胚成纤维细胞,使其在鸡胚成纤维细胞内与禽痘病毒基因组发生同源重组,产生表达HA和IL-18的重组禽痘病毒(rFPV-HA-IL-18).在含有X-gal的营养琼脂培养基上进行蓝斑筛选后,对重组禽痘病毒又进行了多次蚀斑克隆.[结果]以重组禽痘病毒DNA为模板,利用HA基因和鸡IL-18基因引物进行PCR,分别扩增出1条约1.7 kb带和1条0.6 kb左右的带.以间接免疫荧光试验、T细胞转化试验和SPF雏鸡免疫接种证实重组禽痘病毒能表达HA和鸡IL-18,并初步证明鸡IL-18增强HA免疫作用.[结论]重组禽痘病毒能表达具有生物学活性的HA和鸡IL-18.     

共表达新城疫病毒F基因和H9亚型禽流感病毒HA基因的重组鸡痘病毒

应用RT PCR扩增出新城疫病毒F4 8E8株融合蛋白 (F)基因 ,将其克隆入pGEM Teasyvector构建重组质粒pGEM TF并进行测序确证。分别从pGEM T和pUCHA切下F基因和H9亚型禽流感病毒F株 (A chicken china F 1 998)血凝素 (HA)基因 ,通过一系列分子生物学操作步骤插入到质粒pFPV7S中的鸡痘病毒基因组复制非必需片段构建重组质粒p7SHF ,其中F基因和HA基因分别由鸡痘病毒启动子PE L和合成启动子PS调控。最后将P1 1 LacZ报告基因表达盒插入质粒p7SHF获得转移载体pFPVHF ,用以转染已预先感染鸡痘病毒 2 82E4疫苗株的鸡胚成纤维细胞 (CEF)。通过在含有X Gal的营养琼脂上连续挑选蓝色病毒蚀斑获得并纯化重组病毒。PCR和Southernblot检测证实了F基因和HA基因已插入鸡痘病毒的基因组 ;间接免疫荧光试验结果表明重组病毒能够同时正确表达HA和F蛋白。     

表达H9亚型禽流感流毒血凝素基因的重组鸡痘病毒及其免疫效力

以RT－PCR法扩增获得H9亚型禽流感病毒（AIV）分离株（A／Chicken/China/F/1998)的血凝素（HA）基因,将其定向插入鸡痘病毒转移载体1175的痘苗病毒启动子P7．5的下游,得到重组转移载体1175HA,以脂质体转染法将1175HA转染至已感染鸡痘病毒282E4疫苗株（wt-FPV)的鸡胚成纤维细胞（CEF）中,通过在含X－gal的营养琼脂上连续挑选蓝色病毒蚀斑获得并纯化rFPV-HA,以间接免疫荧光法证实感染rFPV-HA的CEF表达了HA,rFPV-HA在免疫7日SPF鸡7天后即能诱生可检出的血凝抑制（HI）抗体,14天后诱生的HI抗体能达到高峰,且诱生的HI抗体保护较高水平达55天,在7日龄SPF鸡及含抗FPV母源抗体的商品鸡上进行了免疫效力试验表明,rPV-HV能显著抑制静脉攻毒后免疫鸡从泄殖腔的排毒,效果与AIV全病毒灭活苗相当。     

共表达H5和H9亚型禽流行性感冒病毒血凝素基因的重组禽痘病毒及其免疫效力

为了构建更为安全有效能同时抵抗高致病性H5亚型和低致病忡H9亚型禽流行性感冒(禽流感)病毒的基因工程疫苗,将H5和H9亚型禽流感病毒分离株的血凝素(HA)基因,分别由鸡痘病毒早晚期启动子PS和PE／L调控其转求,定向插入鸡痘病毒转移载体p11s中,获得H5A和H9A基因分别处于PS及PE／L启动子转录调控下的重组转移载体p11SH5H9。以FuGene^TM6转染法将p11SH5H9转染至已感染鸡痘病毒282E4疫苗株(wt-FPV)的鸡胚成纤维细胞(CEF)中。p11SH5H9与wt—FPV基因组DNA之间的同源重组产生了重组鸡痘病毒rFPV11SH5H9。通过在含X-gal的营养琼脂上连续挑选蓝色病毒蚀斑获得并纯化rFPV-11SH5H9。以间接免疫荧光法试验证实,纯化的rFPV-11SH5H9感染的CEF能同时表达H5A和H9A。初步的动物试验表明,用10^5PFU的rFPV-11SH5H9免疫无特定病原体(SPF)鸡,免疫后血凝抑制(HI)抗体监测阳性率均为100％(8／8);该重组病毒能显著抑制H9亚型AIV滴鼻、点眼后7日龄SPF鸡从气管和泄殖腔排毒,同时也能抵抗H5亚型AIV肌肉注射后对7日龄SPF鸡致死性攻击,保护率均为100％,显示出一定的应用前景。     

表达H9亚型禽流感病毒血凝素基因的重组鸡痘病毒及其免疫效力

以RTPCR法扩增获得H9亚型禽流感病毒(AIV)分离株(A/Chicken/China/F/1998)的血凝素(HA)基因,将其定向插入鸡痘病毒转移载体1175的痘苗病毒启动子P75的下游,得到重组转移载体1175HA。以脂质体转染法将1175HA转染至已感染鸡痘病毒282E4疫苗株(wtFPV)的鸡胚成纤维细胞(CEF)中,通过在含Xgal的营养琼脂上连续挑选蓝色病毒蚀斑获得并纯化rFPVHA。以间接免疫荧光法证实感染rFPVHA的CEF表达了HA。rFPVHA在免疫7日龄SPF鸡7天后即能诱生可检出的血凝抑制(HI)抗体,14天后诱生的HI抗体到达高峰,且诱生的HI抗体保持较高水平达55天。在7日龄SPF鸡及含抗FPV母源抗体的商品鸡上进行的免疫效力试验表明,rFPVＨＶ能显著抑制静脉攻毒后免疫鸡从泄殖腔的排毒,效果与AIV全病毒灭活苗相当。     

利用Cre-loxP自动敲除H5亚型禽流感病毒血凝素重组鸡痘病毒中的报告基因

研究去除重组鸡痘病毒中的报告基因,构建一株只含目的基因的重组毒。将H5亚型AIV的HA基因作为靶基因,两侧含loxP序列的GFP表达盒插入鸡痘病毒重组臂基因构建了转移质粒载体,将其与脂质体混合转染CEF细胞,获得了表达H5和GFP的鸡痘病毒重组体。通过二次转染,利用Cre酶自动敲除重组病毒中的GFP基因,最终获得了只含H5血凝素基因表达盒的重组鸡痘病毒。免疫荧光和病毒滴度测定结果表明,经过连续传代后重组病毒仍然稳定复制并表达H5血凝素。用10⁵PFU和2×10⁵PFU rFPV H5免疫SPF鸡,28d后,免疫组鸡抗体平均滴度(HI)分别达到4log 2和4.5log 2,结果表明,H5HA基因重组病毒能刺激鸡群产生较高特异抗体。     

H5亚型禽流感重组鸡痘病毒活载体疫苗的构建及其遗传稳定性与免疫效力

以鹅源H5亚型禽流感病毒(AIV)基因组为模板,用RTPCR扩增血凝素（Hemagglutinin, HA）基因,克隆入鸡痘病毒表达载体pFG1175,转染鸡痘病毒感染的鸡胚成纤维细胞,通过蓝斑筛选和间接免疫荧光检测,获得表达HA基因的重组鸡痘病毒（Recombinant fowlpox virus, rFPVHA）。rFPVHA经鸡胚成纤维细胞连续传15代后,报告基因LacZ和HA基因可稳定表达。用103PFU和105PFU的rFPVHA免疫无特定病原体的(Specific pathogen free, SPF)鸡,免疫后22d 血凝抑制(Hemagglutinin inhibition,HI)抗体监测阳性率分别为0%和20%,但均抵御了H5亚型毒株的致死性攻击,保护率为100%。结果表明,构建了表达HA基因的重组鸡痘病毒,该重组病毒具有良好遗传稳定性,免疫鸡可提供完全保护,显示出了一定的应用前景。     

共表达H9亚型禽流行性感冒病毒血凝素基因和鸡Ⅱ型干扰素基因的重组鸡痘病毒及其免疫效力

为了构建更为安全有效的抗低致病性H9亚型禽流行性感冒（流感）的基因工程疫苗,将包含有H9亚型禽流感病毒分离株的血凝素（HA）基因、鸡Ⅱ型干扰素（IFN－Ⅱ）全长cDNA序列及调控其转录的鸡痘病毒早晚期启动子（PE／L）的基因片段,定向插入鸡痘病毒转移载体1175的痘苗病毒启动子P7．5的下游,得到HA和IFN－Ⅱ基因分别处于P7．5及PE／L转录调控下的重组转移载体1175HAIFN。以脂质体转染法将1175HAIFN转染至已感染鸡痘病毒282E4疫苗株（wt-FPV)的鸡胚成纤维细胞（CEF）中。1175HAIFN与wt-FPV基因组DNA之间的同源重组产生了重组鸡痘病毒rFPV-HA-IFN-Ⅱ。通过在含X-gal的营养琼脂上连续挑选蓝色病毒蚀获得并纯化rFPV-HA-IFN-Ⅱ。以间接免疫[荧光法和细胞病变抑制试验证实,纯化的rFPV-HA-IFN-Ⅱ感染的CEF能以非融合的方式同时表达HA和具有抗HSV活性的鸡IFN－Ⅱ。动物试验表明,rFPV-HA-IFN-Ⅱ能显著抑制静脉攻毒后1日龄SPF鸡及含抗FPV母源抗体的商品鸡从泄殖腔排毒,且能减轻单表达HA的重组鸡痘病毒（rFPV-HA)抑制日龄SPF雏鸡增重的副作用。     

H5N1亚型AIVHA抗原表位的高效表达及其抗原活性分析

血凝素(hemagglutinin,HA)蛋白是禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)的一个重要表面抗原性蛋白,在疾病诊断和防治上有重要意义。本研究为了探讨一种更为简便有效的HA重组蛋白表达途径,利用生物信息学软件,对H5N1亚型AIVHA基因编码的氨基酸序列进行分析,在分析其在大肠杆菌中的密码子偏好性、稀有密码子分布情况及有关蛋白的抗原性等重要特性后,构建了HA抗原表位重组表达质粒pET-32a(+)-HA。经测试,该重组质粒在1mmol/LIPTG诱导剂作用下诱导过夜,能在大肠杆菌Rosetta-gami B(DE3)中高效表达,并得到48.1kD大小的目的重组表达蛋白。重组蛋白用6×His-tagged protein纯化试剂盒纯化后,与福氏佐剂等量混合制备成抗原,以200μg/鸡的剂量皮下注射2月龄SPF鸡3次,采血分离血清。Western-Blot试验结果表明,该重组表达蛋白能分别与所制备的高免鸡血清及H5N1亚型AIV阳性血清发生特异性反应,在硝酸纤维素膜上出现特异性杂交带。说明本试验研究的HA抗原重组表达蛋白具有良好的免疫原性和反应原性,保留了HA蛋白的抗原活性,提示该重组蛋白在H5亚型AIV的防治技术研究中具有重要的实际应用价值。     

Close relationship between the 2009 H1N1 virus and South Dakota AIV strains

Although previous publications suggest the 2009 pandemic influenza A (H1N1) virus was reassorted from swine viruses of North America and Eurasia, the immediate ancestry still remains elusive due to the big evolutionary distance between the 2009 H1N1 virus and the previously isolated strains. Since the unveiling of the 2009 H1N1 influenza, great deal of interest has been drawn to influenza, consequently a large number of influenza virus sequences have been deposited into the public sequence databases. Blast analysis demonstrated that the recently submitted 2007 South Dakota avian influenza virus strains and other North American avian strains contained genetic segments very closely related to the 2009 H1N1 virus, which suggests these avian influenza viruses are very close relatives of the 2009 H1N1 virus. Phylogenetic analyses also indicate that the 2009 H1N1 viruses are associated with both avian and swine influenza viruses circulating in North America. Since the migrating wild birds are preferable to pigs as the carrier to spread the influenza viruses across vast distances, it is very likely that birds played an important role in the inter-continental evolution of the 2009 H1N1 virus. It is essential to understand the evolutionary route of the emerging influenza virus in order to find a way to prevent further emerging cases. This study suggests the close relationship between 2009 pandemic virus and the North America avian viruses and underscores enhanced surveillance of influenza in birds for understanding the evolution of the 2009 pandemic influenza.     

H9与H5亚型禽流感病毒血凝素基因的快速鉴别

建立一步法RT-PCR检测方法,对禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)的血凝素(Hemagglutinin,HA)分型进行了研究。参照AIV的HA基因序列设计1对引物,对H9和H5亚型AIV进行了扩增,产物大小分别为579bp和177bp。经测试,该引物不与新城疫病毒等鸡的其它传染性病原及鸡肌肉组织的核酸发生交叉反应。敏感性分析发现,从50pg的AIV总RNA中亦能扩增到目的条带。结果表明,此次利用1对引物建立的一步法RT-PCR方法简便适用,可以在一次反应中同时将H9和H5亚型AIV进行快速检测和分型。另外,两个亚型的扩增产物均包含了HA裂解位点在内的基因序列,可通过测序推导氨基酸顺序以预测H5或H9亚型禽流感病毒的潜在毒力。     

表达H5N1亚型禽流感病毒HA基因重组腺病毒的遗传稳定性分析及滴度测定

研究表达H5N1亚型禽流感病毒HA基因重组腺病毒pAd-H5的遗传稳定性及重组病毒的滴度测定。将重组腺病毒pAd-H5在293细胞上连续传代20次,取第5、10、15和20代的重组病毒采用PCR 方法扩增禽流感病毒HA基因,并进行基因序列测定分析;用标记为GFP的快速测定法计算出20代次时重组病毒的滴度。从各代重组病毒DNA 中均扩增出了约1 700bp的目的条带,与HA基因片段长度一致,基因序列分析表明：第5 、10 、15 代重组病毒中的HA基因序列与原始转移载体序列完全一致,第20代重组病毒插入基因有1处发生了点突变(即HA基因417位A→G),但其编码的氨基酸未发生变化(即同义突变),表明表达的目的蛋白抗原表位未发生变化;计算出的重组病毒滴度为108.875pfu/0.1ml。重组腺病毒pAd-H5在293细胞上连续传代20次,具有良好的遗传稳定性,重组腺病毒的病毒滴度相对较高。     

以减毒沙门氏菌运送的H5亚型禽流感病毒DNA疫苗的构建及其对小鼠的免疫原性

根据GenBank中已发表的H5亚型禽流感病毒HA基因序列,设计一对引物,通过RTPCR扩增鹅源H5亚型高致病力禽流感病毒HA基因,测序确认后,将其克隆入真核表达载体pVAX1和asdpVAX1得到重组表达载体pVAX1HA和asdpVAX1HA。将重组质粒转染P815细胞,经间接免疫荧光试验证实,HA基因在细胞内得到了瞬时表达。进一步将重组质粒转化减毒鼠伤寒沙门氏菌X4550得到两种运送DNA疫苗的重组沙门氏菌X4550（pVAX1HA）和X4550（asdpVAX1HA）,以1×109CFU/只的剂量两次口服免疫BALB/c小鼠,免疫小鼠不仅可以检测到HA特异性的血清抗体应答,而且还能抵抗稳定表达H5亚型禽流感病毒HA基因的P815肥大细胞瘤的攻击,说明该运送DNA疫苗的减毒沙门氏菌系统在体内能够成功释放所携带的质粒,并且能够刺激机体产生保护性免疫应答。     

人源H5N1禽流感病毒血凝素分子遗传变异特征分析

从GenBank获取已公布的人及相应国家禽感染的H5N1禽流感病毒HA核酸和蛋白序列,用生物软件ClustalX1.83和MEGA4.0对HA基因序列和蛋白分析,构建HA核苷酸遗传进化树.结果表明,HA蛋白上再次出现既能与人又能与禽受体特异性结合的QNG;东南亚和东亚人感染毒株亲缘关系密切,西亚、南亚和非洲人感染毒株遗传距离近;进化树组成和HA蛋白关键位点氨基酸的变异,揭示多数国家的人感染的毒株与当地禽感染毒株高度同源,具有地域性特征,部分国家之间存在着病毒扩散现象.     

双色荧光多重PCR技术及在禽流感病毒检测中的应用

为快速检测7种亚型禽流感病毒,对引物进行双色荧光标记,建立双色荧光多重PCR(DFM-PCR)方法,通过运用DFM-PCR可一次检测出7种禽流感病毒亚型。此方法为应用于病毒或病原等一些要求快速、高通量的检测领域打下基础,而且为禽流感病毒检测以及其他种类病毒等病原检测提供了一种新型方法。     

H5N1亚型禽流感病毒进化的研究进展

由H5N1流感病毒引起的高致病性禽流感,在禽类之间广泛传播。当人类接触这些禽类时,可能会被感染并产生严重的呼吸道症状,且死亡率高达60%。血凝素(hemagglutinin,HA)是H5N1病毒中和抗体的主要抗原,为了便于对病毒的HA突变进行研究,根据HA遗传基因的差异远近,所有的H5病毒株都被划分在20个分支内。对于H5N1病毒进化的研究在禽流感疫苗的研制、禽流感大流行的预防等方面均具有重要意义。现对禽流感、H5N1病毒特征、血凝素的结构功能、H5N1病毒的分支以及病毒进化的研究进行概述。     

Reference Gene Selection for Normalization of PCR Analysis in Chicken Embryo Fibroblast Infected with H6N1 AIV

Chicken embryo fibroblasts(CEFs)are among the most commonly used cells for the study of interactions between chicken hosts and H5N1 avian influenza virus(AIV).In this study,the expression of eleven housekeeping genes typically used for the normalization of quantitative real-time PCR(QPCR)analysis in mammals were compared in CEFs infected with H5N1 AIV to determine the most reliable reference genes in this system.CEFs cultured from 10-day-old SPF chicken embryos were infected with 100 TCID50 of H5N1 AIV and harvested at 3,12,24 and 30 hours post-infection.The expression levels of the eleven reference genes in infected and uninfected CEFs were determined by real-time PCR.Based on expression stability and expression levels,our data suggest that the ribosomal protein L4(RPL4)and tyrosine 3-monooxygenase tryptophan 5-monooxygenase activation protein zeta polypeptide(YWHAZ)are the best reference genes to use in the study of host cell response to H5N1 AIV infection.However,for the study of replication levels of H5N1 AIV in CEFs,the β-actin gene(ACTB)and the ribosomal protein L4(RPL4)gene are the best references.