枯草杆菌抗利福霉素孢子形成突变体的基因定位和RNA聚合酶活性

分离到两株抗利福霉素的孢子形成突变体,其产孢子比率低于千分之五。三点转化杂交表明:抗利福霉素和寡孢子性状都是由于染色体上rfm座位的单一突变引起。亲株和突变株的营养期RNA聚合酶(Rpase~(2)))在离体条件下能转录φ_e噬菌体DNA和poly d(A-T)。但是,突变体-91的孢子形成期Rpase对φ_e DNA的离体转录活性要比亲株的高5倍。而且,营养期和孢子形成期的RNA聚合酶对Mg~( )、Mn~( )有不同的反应。     

瑞德西韦的合成、作用机制与应用

瑞德西韦是一种具有广谱抗RNA病毒活性的核苷类似物,通过抑制病毒中RNA依赖性的RNA聚合酶活性从而发挥作用。在药物设计中,首先筛选了具有抑制病毒生长活性的核苷类似物,确定了鸟嘌呤类似物和戊糖的基本结构,再对其进行磷酸修饰、前药修饰和实验筛选得到最终结构。在药物合成方面,通过对两代合成路线的对比,讨论了反应条件和手性合成对其合成效率的影响,强调反应条件和立体化学在合成中的重要作用。在应用方面,概要阐述了在各类RNA病毒病治疗中的实验和应用情况。通过上述介绍,以期对瑞德西韦有一个相对全面的认识。     

淀粉酶生产菌(Bacillus subtilis BF-7658)孢子形成突变体的分离和特性

从一个工业上生产α-淀粉酶的枯草杆菌(Baciltus subtilis)BF-7658菌株中分离出自发的依赖链霉素、抗红霉素孢子形成突变体。这些突变体能正常营养生长,但不能正常形成孢子;同时蛋白酶、抗菌素活性降低,转化分析说明这些性状的改变是单一突变的结果。     

大肠杆菌严谨型RNA聚合酶的筛选及体内转录活性测定

利用选择性培养基筛选大肠杆菌自然突变菌株,经噬菌体P1转导和蛋白质互补试验,发现一株突变体(LCH001)的突变基因发生在编码RNA聚合酶β′亚基的rpoC基因上,经DNA序列分析,发现突变位点发生在第3406个碱基上,由G变成了T,导致编码的氨基酸由甘氨酸(GGT)变成半胱氨酸(TGT)。体内转录试验表明该突变RNA聚合酶转录严谨型启动子控制基因的活性显著降低,其β-半乳糖苷酶的活性是野生型菌株的18%,而转录非严谨型启动子控制基因的活性显著提高,其β-半乳糖苷酶的活性约是野生型菌株的5倍。研究结果对探讨RNA聚合酶结构与功能的关系以及RNA聚合酶在细菌严谨反应过程中的作用具有重要意义。     

恩拉霉素生产菌株的遗传改造

【目的】提高杀真菌素链霉菌发酵生产恩拉霉素的产量。【方法】利用定点突变技术,对恩拉霉素生产菌株杀真菌素链霉菌F1中影响细胞次级代谢及抗生素合成的核糖体S12蛋白的编码基因rps L进行改造,将第43位的赖氨酸(Lys)分别替换为天冬酰胺(Asn)和精氨酸(Arg),并对改造菌株L-M1(Asn43)和L-M2(Arg43)的生长特性、抗生素合成以及摇瓶发酵性能进行研究。【结果】与野生型菌株相比,改造菌株的生长特性及生理生化特性均发生了明显的改变:产孢周期明显缩短,野生型菌株在MS培养基中,28°C下需要培养5-7 d后才能产生孢子,而在相同条件下,改造菌株3 d后就能产生大量的孢子;恩拉霉素产量相对提高,摇瓶发酵条件下,改造菌株L-M1(Asn43)和L-M2(Arg43)的恩拉霉素产量分别可达到1 334 U/m L和1 456 U/m L,与野生型菌株F1相比分别提高了11.9%和22.1%。【结论】通过遗传改造,恩拉霉素的产量得到了提高,为其他位点的遗传改造提供了可行性。     

拟南芥质体定位的叶酰谷氨酸合成酶基因在低氮条件下的功能分析

叶酰聚谷氨酸合成酶(folylpolyglutamate synthetase,FPGS)在细胞的不同位置负责将多个谷氨酸残基逐个加在单谷氨酸四氢叶酸(tetrahydrofolate,THF)的γ-羧基上,从而形成有活性的多尾形式四氢叶酸。AtDFB是定位在质体中的FPGS,利用AtDFB基因的T-DNA插入突变体Atdfb-3,通过比较野生型拟南芥及突变体在不同氮源条件下的生长状态以了解AtDFB基因的生物学功能。结果表明,低氮条件下AtDFB基因功能的缺失导致Atdfb-3突变体主根的急剧缩短,叶酸含量的明显下降;而在Atdfb-3突变体中过表达AtDFB基因后,在低氮条件下的表型恢复至野生型拟南芥水平,并且叶酸含量有所提高。综上所述,AtDFB基因在拟南芥叶酸合成代谢途径中发挥着重要作用,可能影响低氮环境下植物主根的发育。     

啤酒酵母两个品系孢子形成特性的观察

本项研究利用啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)正常品系2558和呼吸缺陷突变体2558-1,通过正常的孢子形成培养条件、改变孢子形成培养温度及细胞密度等多项试验,观察子囊形成率的变化及品系间差异。不同品系在上述试验条件下孢子形成特性的明显变异与细胞生活周期中减数分裂受影响有关。     

AtCPL1调控拟南芥开花的机制

RNA聚合酶II CTD磷酸化酶1 (CPL1)作为影响RNA聚合酶II磷酸化水平的重要因子, 在植物逆境响应、离子吸收以及成花诱导等生命过程中扮演重要角色。为深入探究CPL1参与植物开花时间调控的作用机制, 以拟南芥(Arabidopsis thaliana) AtCPL1突变体cpl1-3和fry2-1为研究材料, 观察了长日照条件下突变体与野生型的开花时间, 并利用荧光定量PCR技术对突变体中开花相关基因的表达情况进行了检测。结果表明: 在长日照条件下, 突变体cpl1-3和fry2-1抽薹时的莲座叶数目均显著多于野生型, 且表现出明显的开花时间延迟现象; 荧光定量PCR分析显示, 突变体cpl1-3和fry2-1中开花抑制因子miR156a、TOEs和SMZ基因的表达量较野生型显著升高, 而开花促进因子FT、FD、CO和miR172基因的表达量则显著降低。由此推测, AtCPL1通过调控miR156和miR172的表达水平进而影响下游开花相关基因TOEs、SMZ、FT、FD及CO等的表达, 从而实现对拟南芥开花时间的调控。     

水稻幼苗条纹突变体yss1的转录组分析

利用60Co辐射诱变籼稻品种"Ⅱ-32B",筛选得到一个水稻幼苗条纹突变体yss1,该突变体在水稻五叶期前表现出明显的条纹叶表型;色素分析表明yss1叶片中叶绿素和类胡萝卜素含量明显低于野生型,五叶期后突变体和野生型无显著差异。利用转录组分析水稻三叶期野生型和突变体yss1中的基因表达,表明与野生型相比,yss1中表达差异显著的基因432个,其中274个表达上调,158个表达下调。GO分析显示叶绿素合成途径中多数基因表达上调,类胡萝卜素合成过程中的相关基因受到不同程度地调控。因此,推测YSS1基因通过调节叶绿素和类胡萝卜素合成过程中的基因表达,进而调控光合色素的合成。     

黄瓜花叶病毒2b蛋白C末端无抑制局部RNA沉默的活性

目的:黄瓜花叶病毒 (Cucumber mosaic virus,CMV) 编码的2b蛋白具有RNA沉默抑制子的功能,其C末端氨基酸序列非常保守。为了明确2b蛋白C末端保守序列在RNA沉默抑制中的作用,构建了CMV Q株系野生型2b及其C末端缺失突变体2b^delC的植物瞬时表达载体。通过农杆菌共渗滤法对野生型2b及其C末端突变体的沉默抑制子活性进行了分析。结果与结论:烟草接种叶片中野生型2b及其C末端突变体的Western blot检测表明,野生型2b蛋白与其C末端突变体在植物中积累水平变化不大,说明2b蛋白C末端氨基酸残基在维持2b蛋白在植物细胞中的稳定性方面无作用。在整株、细胞和分子水平上分别比较了野生型2b及其突变体2b^delC对共表达GFP的表达量影响,结果表明在所有的测定结果中二者均无明显地差异,说明2b蛋白C末端94-111位氨基酸在抑制局部RNA沉默上无生物学活性,讨论推测C末端应不存在与小RNA结合的结构域。     

圈卷产色链霉菌san7324和san7324L基因阻断对形态分化和尼可霉素产生的影响

【目的】圈卷产色链霉菌全局性调控基因wblA阻断突变后,尼可霉素不再产生。RNA-seq和转录分析表明san7324基因在野生型菌株中可以正常转录,而在wblA阻断突变株(ΔwblA)中不能转录,为此本文旨在揭示san7324与尼可霉素产生的关系。【方法】利用同源双交换策略对san7324进行基因阻断,而后通过基因遗传回补及对尼可霉素生物合成相关基因的转录分析等方法研究san7324的功能。【结果】在相同培养条件下,阻断突变株Δsan7324与野生型菌株相比失去了合成尼可霉素的能力。我们通过同源比对发现圈卷产色链霉菌中还存在一个与san7324同源的基因san7324L,该基因的阻断导致尼可霉素产量降低。当san7324和san7324L两个基因同时被阻断后,得到的突变株Δsan7324-san7324L生长稀疏而且不能正常发育分化形成灰色表型的孢子或孢子链,只能形成白色表型的气生菌丝,同时也丧失了合成尼可霉素的能力。当这两个基因(san7324-san7324L)回补双突变株后,则恢复了野生型的表型(能形成孢子链并恢复尼可霉素的产生)。进一步的研究初步表明san7324和san7324L的阻断主要影响了尼可霉素生物合成基因簇中途径特异性调控基因sanG的转录水平,从而影响圈卷产色链霉菌的发育分化和尼可霉素的产生。【结论】该结果为链霉菌形态分化与生理代谢关系的研究提供了更多的证据,同时为多效调控基因wblA作用机制的阐明奠定了基础。     

热激条件下拟南芥Athspr突变体叶片蛋白的表达分析

以拟南芥野生型和突变体Athspr为材料,采用双向电泳技术对其在0 h（对照）、2 h 及8 h 热激条件下的叶片全蛋白进行了分离。应用ImageMaster软件从以上蛋白电泳图谱中分别鉴定出1000多个蛋白点,发现其蛋白表达谱在野生型和突变体中存在明显差异。同时选取在野生型和突变体中表达明显有差异的3个高丰度蛋白质点进行了质谱鉴定,并进一步通过GPS-MASCOT进行了数据库检索,鉴定出这三个蛋白质组分分别为富含甘氨酸的RNA 结合蛋白7、细胞色素b6-f复合物铁硫亚单位及放氧增强蛋白1-2。以上3个蛋白均与植株在胁迫条件下的抗性有关。推测由于T-DNA 的插入使得突变体中Athspr基因的功能受到了影响,进而影响了其下游其他基因的表达和上述3种蛋白的表达与功能,产生了突变体的耐热能力以及其他逆境条件下抗逆性下降的一系列表型改变。     

研究枯草杆菌孢子形成的新途径

采用简单的选择技术,从枯草杆菌(Bacillus subtils)中选择到一类在代谢物阻遏的条件下,仍能形成孢子的突变体。用来进行研究的突变体在以硫铵为氮源、葡萄糖为碳源的最低培养基上能够正常生长。用这些突变体进行的研究表明:一种诱导酶——3-羟基丁酮脱氢酶的代谢物阻遏和孢子形成的代谢物阻遏之间,并无紧密的相关。其中有些突变体在加各种测试碳源的条件下,都能形成孢子;另外一些突变体却只对用来分离突变体的碳源有抗性。这就表明对于孢子形成的代谢物阻遏,是受几个代谢步骤的影响的。     

γ-射线辐射诱导水稻黄化转绿叶色突变体X611的特性研究

利用60Coγ-射线辐照粳稻秀水11愈伤组织,在诱变后代中发现了一份黄化转绿叶色突变体X611,并对其表型特征、温度敏感性、生理特性以及农艺性状进行研究。在较低温度17℃条件下,该突变体X611幼苗叶色呈浅黄绿色;在温度为25℃时,X611幼苗叶色呈黄绿色;温度升高至30℃,突变体叶色转为浅绿色。突变体的这种叶色变化特性说明其叶色性状具有低温敏感性。在不同播种时期,突变体X611幼苗期叶片光合色素含量均较野生型秀水11明显下降;但在抽穗期突变体与野生型叶片光合色素含量相接近,净光合速率也表现出同样的趋势。与野生型相比,突变体X611株高平均值降低;剑叶长、剑叶宽、穗长、有效穗数、穗粒数、结实率和千粒重差异不显著。此叶色突变体农艺性状良好,在水稻育种中有较好的育种利用价值。     

蛋白激酶抑制剂Flavopiridol对流感病毒复制的体外抑制作用

【目的】在细胞水平上研究黄酮类化合物flavopiridol的抗流感病毒效果,初步探索了其抗流感病毒的机制。【方法】首先用Western blot初步检测了在蛋白激酶抑制剂flavopiridol处理下流感病毒NP和M1蛋白的水平,然后通过免疫荧光实验观察了宿主细胞中流感病毒vRNP的合成,又利用噬斑实验检测了flavopiridol对病毒复制的影响,最后通过检测flavopiridol处理的宿主细胞内RNA聚合酶Ⅱ的磷酸化状态和病毒各种RNA的合成量,探究了flavopiridol抑制流感病毒复制的机理。【结果】结果表明,flavopiridol在细胞水平上可以显著抑制流感病毒蛋白质和vRNP的合成及病毒的复制,同时flavopiridol也可以抑制宿主RNA聚合酶Ⅱ大亚基CTD结构域七肽重复序列中的2位丝氨酸的磷酸化来抑制聚合酶的转录延伸活性,显著地减少病毒vRNA的合成。【结论】Flavopiridol可以通过抑制宿主细胞RNA聚合酶Ⅱ的转录延伸活性有效地抑制流感病毒的复制。     

日本七鳃鳗Arg-Gly-Asp毒素蛋白Lj-RGD3野生型与RGD全缺失突变体Lj-112的抗血管新生作用

七鳃鳗Arg-Gly-Asp (RGD) 毒素肽Lj-RGD3与富含组氨酸糖蛋白HRG具有序列同源性,而RGD毒素蛋白及HRG都具有抑制血管新生的活性,但作用靶点不同。为研究Lj-RGD3结构与功能的关系,对野生型Lj-RGD3及其RGD全缺失突变体Lj-112进行了抗血管新生功能研究。将3个RGD模体的全缺失突变体基因Lj-112全序列合成后构建于pET-23b载体,对野生型Lj-RGD3及突变体 Lj-112蛋白进行IPTG诱导表达,重组蛋白经组氨酸亲和层析纯化;采用MTT法测定野生型和突变体蛋白对人     

氧化还原对NDPK-A及突变体磷酸转移酶活性的影响

对核苷二磷酸激酶A(NDPK-A)及其4种半胱氨酸突变体进行诱导表达及纯化,测定它们在氧化还原条件及正常条件下的磷酸转移酶活性,研究氧化还原及二硫键异构对NDPK-A及突变体活性的影响。将实验室之前构建成功的野生型NDPK-A(PBV-NDPK-A)及4种突变型NDPK-A基因(PBV-NDPK-A C4S,PBV-NDPK-A C109S,PBV-NDPK-A C145S,PBV-NDPK-A C4/109/145S)在大肠杆菌中高效表达;以DEAE-sepharose Fast Flow离子交换层析与Cibacron Blue 3GA Sepharose CL-4B亲和层析技术纯化目的蛋白;HPLC法测定比较野生型NDPK-A及突变体在氧化还原和正常环境下磷酸转移酶活性。结果显示,NDPK-A及突变体在大肠杆菌中高效表达;经纯化分别获得了均一的NDPK-A蛋白及突变体蛋白,纯度均达到98%;在还原环境下NDPK-A及突变体的磷酸转移酶活性均高于正常环境下的活性,但是在氧化环境下的磷酸转移酶活性明显低于正常环境下。氧化还原环境对NDPK-A结构异构及磷酸转移酶活性有一定的影响,提示氧化还原环境可能调控NDPK-A二硫键的形成,影响蛋白的聚集状态,从而影响蛋白的磷酸转移酶活性,并且NDPK-A结构中可能有更为复杂的氧化还原调控酶活性机制。     

光下叶绿素缺乏的大麦突变体NYB中叶绿素合成再探

研究一种原叶绿素酯还原酶（POR）的大麦突变体Ⅳ阳光下合成叶绿素的结果表明,NYB中PORB的含量比野生型低。NYB前质体中原片层体的大小和数量与野生型差不多,但其结构比野生型的松散。暗中生长的突变体内POR蛋白复合物LHPP比野生型少。不同光照强度下叶绿素积累的结果显示,光照度越强,突变体与野生型的叶绿素差异越显著。由于porB是单拷贝的,所以推测突变体中部分porB mRNA可能产生错误的剪切拼接,以致光下突变体Ⅳ阳仍然能合成叶绿素。     

拟南芥CEO1基因在氯化镉诱导的氧化胁迫中的作用

以拟南芥ceo1、突变体为材料,研究CEO1（clone eight-one）在镉胁迫条件下作用的结果表明,与野生型植株相比,150μmol·L^-1的CdCl2处理10d后,拟南芥ceo1突变体表现为植株生长矮小,叶片卷曲发黄,根系短小。镉处理后,拟南芥突变体幼苗叶中H2O2的积累较多;镉处理1h后的突变体中抗坏血酸过氧化物酶（APX）活性明显上升,至2h时又开始下降,而镉处理2h后,野生型APX活性才开始增加。镉处理2h后的野生型的谷胱甘肽还原酶（GR）显著增加,而突变体无明显变化。两种类型拟南芥的超氧化物歧化酶（SOD）与过氧化氢酶（CAT）的活性没有明显差异。     

地中海拟无枝酸菌“硝酸盐效应”的研究进展

地中海拟无枝酸菌"硝酸盐效应"是指发酵基质中的硝酸盐在一定浓度下大幅度促进该菌合成利福霉素,并对初级代谢产生多种影响的现象。针对该效应,本实验室开展了多年的研究,阐明硝酸盐主要通过两个方面促进利福霉素的生物合成:一方面,硝酸盐增加利福霉素生物合成前体的供给(如UDP-葡萄糖、AHBA、丙二酰Co A以及甲基丙二酰Co A等),尤其是通过抑制体内脂肪酸的合成来保障利福霉素前体丙二酰Co A的供给;另一方面,硝酸盐提升利福霉素生物合成酶基因的表达。因此,在充足的利福霉素前体和合成酶系的协同效应下,菌体生成大量的利福霉素。进一步的工作将围绕"硝酸盐效应"的信号分子、信号转导途径以及相关基因的表达调控和翻译后修饰机制等方面展开。