地衣芽孢杆菌的温和性噬菌体——Ⅱ.DNA分子生物学特性的研究

增殖Blp7、Blp11、Blp16这一类群噬菌体并抽提其DNA,用电镜法测定噬菌体DNA长度为62.75±1.47 kb,并证实它们与λ噬菌体相似,含有一个能使DNA环化的粘性末端。DNA经碱部分变性后,电镜观察可以识别Blp 7 DNA分子的R端与L端。用限制性内切酶EcoR1、BamHI酶切Blp7及Blp16 DNA,经琼脂糖凝胶电泳后,观察到DNA分子的多态性。     

一株地衣芽孢杆菌碱性蛋白酶的研究Ⅰ.

从皖北盐碱地土术中分离到011菌株,对其进行了菌种鉴定以及胞外碱性蛋白酶的初步研究。结果表明：011菌株符合地衣芽孢杆菌种的特征,但该菌芽孢端生、孢囊膨大、中度耐盐、高度耐碱,可在NaCl浓度为13％和pH11的培养基中生长,这些特征又不同于该种几个模式株,因而将011菌株鉴定为地衣芽孢杆菌的一个亚种,命名为地衣芽孢杆菌砀山亚种（Bacillus licheniformis subsp.dangshanensis）。该菌在发酵培养基中能产生较高产量的胞外碱性蛋白酶（725u/mL）。酶的最适作用条件：60℃、pH9.0,该酶在pH6.0-11范围内稳定。     

短小芽孢杆菌1037抗温和性噬菌体菌株的筛选及投产

由短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)260/52诱筛的1037菌株,在500升罐上产碱性蛋白酶的能力稳定在8,000单位/毫升以上,生产能力较出发菌株提高40％以上。但该菌株在10吨罐上的产酶水平并不高于出发菌株。发酵中表现出二级种子种龄显著延长,发酵周期延长,产酶速率低,泡沫增多,菌体生长略有下降等异常现象。发酵液经平板检查出现噬菌斑,从而证明为噬菌体感染。于是,开展了短小芽孢杆菌抗噬菌体菌株的筛选工作。本文报道有关噬菌体抗性菌株的筛选过程及投产情况。     

苏云金芽孢杆菌两株溶原性噬菌体的生物学特性

研究苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)的溶原性及其噬菌体的生物学特性,从生产菌株MZ1中分离了两株溶原性噬菌体。MZ1经诱导后产生直径约为3mm和1mm的噬斑,分离获得属长尾噬菌体科的噬菌体MZTP01和MZTP02两株;分别对6株和7株不同亚种的Bt菌株具有侵染力;免疫血清与相应噬菌体的中和反应K值分别为45和326,且两者无相关抗原性。MZTP01抵抗酸、碱、紫外线和热的能力比MZTP02强,但抵抗有机溶剂的程度比MZTP02弱。MZTP01的潜伏期为80min,裂解量为55;MZTP02的潜伏期为40min,裂解量为175。核酸结构分析均表明为线性dsDNA分子。两基因组DNA的凝胶电泳表明分子量均在9.4~23kb之间,并被HindⅢ酶切分别产生8条和9条清晰条带。该菌株被证明为二元溶原菌,可能是造成生产损失的主要原因;为防治溶原性噬菌体提供了生物学信息。     

碱性蛋白酶生产菌——地衣芽孢杆菌(B. licheniformis)的温和噬菌体

碱性蛋白酶生产菌——地衣芽孢杆菌经丝裂霉素C或紫外线处理,均可诱导释放噬菌体,电镜观察表明噬菌体头部外廓呈六边形,有不收缩的尾部(头部40nm×40nm,尾部107×5,7nm),噬菌体BLL1 DNA对限制酶Eco R Ⅰ,HindⅢ和Bam H Ⅰ敏感,分别切割成8,15,和9个片段,经电泳法测定。噬菌体DNA分子量约相当于23.4kb,根据解链温度计算出噬菌体的G+C含量约为31.2摩尔％,噬菌体提纯的外壳蛋白经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳呈现5条主带,其分子量分别约为78000,72000,55000,39000,35000。     

酱香型白酒发酵中地衣芽孢杆菌前噬菌体的鉴别

【背景】噬菌体是微生物群落的重要组成部分,但传统白酒发酵中噬菌体的分类和存在尚不清楚。【目的】通过检测公共数据库和酱香型白酒发酵中地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)基因组中的前噬菌体整合区域,探究传统酱香型白酒发酵中关键功能菌株的前噬菌体分类和侵染情况。【方法】使用未培养(细菌全基因组分析)和可培养(菌株筛选和特异性PCR反应)技术对不同环境来源和来自酱香型白酒发酵的地衣芽孢杆菌前噬菌体的分类和存在进行解析。【结果】细菌全基因组分析显示,30株来自不同环境的地衣芽孢杆菌基因组中共注释到165个前噬菌体,其中63.6%(105/165)为完整前噬菌体序列。97.1%感染地衣芽孢杆菌的噬菌体属于长尾噬菌体科(Siphoviridae),2.9%属于肌尾噬菌体科(Myoviridae),53.0%完整前噬菌体的基因功能未知。在来自酱香型白酒发酵的B. licheniformis MT-B06中检测到7个前噬菌体整合序列,其中57.1%(4/7)为完整前噬菌体序列,来自酱香型白酒发酵的地衣芽孢杆菌存在多种不同前噬菌体的共感染。来自酱香型白酒发酵的地衣芽孢杆菌前噬菌体存在来自细菌基因组上相邻CotD孢子外壳蛋白(CotD family spore coat protein)基因的水平基因转移。在26株来自酱香型白酒发酵的地衣芽孢杆菌中,69.2%(18/26)存在噬菌体编码主要衣壳蛋白的基因,100.0%(26/26)存在噬菌体编码CotD孢子外壳蛋白的基因。【结论】来自不同环境的地衣芽孢杆菌和酱香型白酒发酵的地衣芽孢杆菌中存在高水平的前噬菌体整合,来自酱香型白酒发酵的地衣芽孢杆菌前噬菌体中广泛存在来源于宿主的CotD孢子外壳蛋白基因的水平基因转移。本研究为首次对传统发酵白酒中噬菌体的分类和存在进行探究,有助于对发酵微生物群落中噬菌体-细菌相互作用加深理解。     

鲍曼不动杆菌噬菌体生物学特性的研究

从污水中分离鉴定鲍曼不动杆菌噬菌体,并对其生物学特性进行分析,为开发针对细菌感染的噬茵体生物制剂提供前期工作.采用双层琼脂法分离可裂解鲍曼不动杆菌的噬菌体,通过负染法电镜观察噬茵体的大小和形态,将噬菌体和宿主菌以不同比例混合,测定噬菌体的最佳感染复数并观察一步生长曲线,提取噬菌体核酸进行酶切电泳分析,通过SDS-PAGE分析噬菌体的结构蛋白和非结构蛋白.成功分离3株可裂解鲍曼不动杆菌的噬菌体(分别命名为ΦAb-1、ΦAb-2和ΦAb-3),电镜显示噬菌体的头部呈二十面体,直径约50nm,有一短尾.噬菌体ΦAb-1的最佳感染复数为10-2,一步生长曲线表明噬菌体在裂解宿主菌时,潜伏期为20 min,爆发期为30 min,裂解量为190 PFU/cell.限制性酶切电泳显示噬菌体ΦAb-1的基因组大小约40 kb左右,为双股环状DNA.SDS-PAGE的噬菌体蛋白电泳包括7种蛋白,分子量在29 ～ 116 ku.噬菌体ΦAb-1、ΦAb-2和ΦAb-3对鲍曼不动杆菌具有很强的裂解毒性.根据其形态、结构和噬菌体分类法,鲍曼不动杆菌噬菌体属于有尾病毒目,足尾病毒科.     

地衣芽孢杆菌温和噬菌体的具有启动子功能片段的克隆

载体pTG402与地衣芽孢杆菌噬菌体B1p7经限制酶酶切并连接后转化大肠杆菌。从全部转化子中抽提质粒DNA,转化枯草杆菌后经苗落原位显色选到22个有启动子功能片段的克隆子。利用邻苯二酚双加氧酶对底物的显色反应,测定了15个克隆子的启动子活性,并绘制了启动子功能最强的重组质粒的酶切图谱。此外,还测定了两个克隆子在枯草杆菌各个生长期的表达情况,发现在对数生长后期表达量太增,认为识别这两个启动子的σ因子可能是σ³⁷。     

短小芽孢杆菌噬菌体的分离及特性

以短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)1037及其抗噬菌体衍生株为指示菌,从噬菌体滋生环境中分离得到10株噬菌斑形态和宿主范围不同的PP系列噬菌体,并对它们的血清型、宿主范围以及对热和对不同pH的稳定性进行了研究。结果表明,在噬菌体滋生的环境中实际存在着不同血清型和宿主范围的噬菌体群体。由PP系列噬菌体与不同宿主菌之间的关系推测,杂菌污染是噬菌体污染的导因,因而认为在工业上防治噬菌体对生产的危害必须采取综合治理措施。     

一株地衣芽孢杆菌碱性蛋白酶的研究I.

从皖北盐碱地土样中分离到 011菌株 ,对其进行了菌种鉴定以及胞外碱性蛋白酶的初步研究。结果表明 :011菌株符合地衣芽孢杆菌种的特征 ,但该菌芽孢端生、孢囊膨大、中度耐盐、高度耐碱 ,可在NaCl浓度为 13%和pH11的培养基中生长 ,这些特征又不同于该种几个模式株 ,因而将 011菌株鉴定为地衣芽孢杆菌的一个亚种 ,命名为地衣芽孢杆菌砀山亚种(Bacilluslicheniformissubsp .dangshanensis)。该菌在发酵培养基中能产生较高产量的胞外碱性蛋白酶 ( 72     

一株地衣芽孢杆菌碱性蛋白酶的研究Ⅱ.

曾分离到一株产碱性蛋白酶的地衣芽孢杆菌011 ,命名为地衣芽孢杆菌砀山亚种。酶的最适作用条件 :pH9 0 ,6 0℃。对该菌株进行连续 4次不同的物理、化学方法的诱变处理。诱变剂为紫外线、亚硝酸、和低能N⁺离子 ,其处理方式包括单独或复合处理两种。最后获得一株高产碱性蛋白酶的变异株 (C₃₀₃)菌株产酶活力从 725u/mL提高到 12425u/mL。该突变株的最适产酶条件为起始pH8.0～9.0 ,培养温度 32℃～37℃ ,振荡培养时间 44～ 48h。     

一株地衣芽孢杆菌碱性蛋白酶的研究I.

从皖北盐碱地土样中分离到 0 1 1菌株 ,对其进行了菌种鉴定以及胞外碱性蛋白酶的初步研究。结果表明 :0 1 1菌株符合地衣芽孢杆菌种的特征 ,但该菌芽孢端生、孢囊膨大、中度耐盐、高度耐碱 ,可在NaCl浓度为 1 3%和pH1 1的培养基中生长 ,这些特征又不同于该种几个模式株 ,因而将 0 1 1菌株鉴定为地衣芽孢杆菌的一个亚种 ,命名为地衣芽孢杆菌砀山亚种(Bacilluslicheniformissubsp .dangshanensis)。该菌在发酵培养基中能产生较高产量的胞外碱性蛋白酶 ( 72 5u/mL)。酶的最适作用条件 :60℃、pH9.0 ,该酶在pH6.0～ 1 1范围内稳定     

地衣芽孢杆菌20386株特性及其生态制剂的研究

作者在1986年从1例正常待产妇女的阴道中,分离出1株革兰氏阳性需氧地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)BL_(20386)株。该株体外试验(In Vitro Test)对金葡萄和白念珠菌具有明显的拮抗作用;体内试验(In vivo Test)表明具有调整肠道菌群和治疗作用。对BL_(20386)株的生物特性、生物毒性、生物拮抗、生物耗氧研究显示了安全、有效的指征,符合生态制剂生产用菌株。用该菌株制备的生态制剂—整肠生, 治疗婴幼儿感染性腹泻和非感染性腹泻治愈率分别为70％和85％;成年人细菌感染性腹泻3天治愈率为50％,5天为81％,7天为96.2％。整肠生具有治疗和预防肠道疾病的前景。     

短小芽孢杆菌缺陷噬菌体

经丝裂霉素c诱发和CsCl密度梯度离心,得到了短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)噬菌体PPO。该噬菌体具有典型的20面体的头部,长而可收缩尾鞘的尾,尾鞘的下端附有基板及尾丝。噬菌体DNA的限制核酸内切酶酶切电泳及其与宿主基因组DNA之间的分子杂交结果证明,噬菌体PPO颗粒内包裹的是寄主DNA,因而它是一缺陷噬菌体。     

多粘芽孢杆菌噬菌体的分离及其特性的研究

从全国18个省、市、自治区的不同类型土壤和污水采集样品193号,在134号样品中分离到多粘芽孢杆菌噬菌体。对其中侵染多粘芽孢杆菌28的23株噬菌体进行了血清学的研究,可区分为四种血清型。对这四种血清型的代表株除测定血清中和反应外,还进行了寄主范围、吸附速度常数和一级生长曲线的测定。同时进行了电子显微镜观察。发现代表株之间存在着显著的差异。从生产方面考虑,我们进行了不同pH对噬菌体的存活影响,以及它们对温度稳定性的研究,可为防治噬菌体的感染提供依据。     

地衣芽孢杆菌原生质体电转化方法的研究

为了解决地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)工业菌株难以转化的问题,将原生质体制备、电穿孔和原生质体再生技术相结合,建立了一种地衣芽孢杆菌原生质体电击转化方法。在对菌体生长状态、溶菌酶作用时间、电转电压、渗透压保护剂等条件进行优化后,试验了将不同类型的表达载体,即游离型质粒p GJ103(3.3kb)和整合型质粒p AX01(9.3kb),分别转入两株地衣芽孢杆菌工业生产菌株B.licheniformis CICC 10181和B.licheniformis CICC 20204中。实验结果显示,对数生长期后期的菌体酶解40min后制备的地衣芽孢杆菌原生质体得率为96%,再生率达25%以上。原生质体与质粒DNA在最适电压0.6k V/mm下电击转化,并以0.5mol/L山梨醇或甘露醇作为渗透压保护剂进行再生培养后,最终游离型质粒的转化率可达0.88×102~1.1×102CFU/μg p GJ103,整合型质粒的转化率达到0.45×102~0.52×102CFU/μg p AX01。该方法为地衣芽孢杆菌野生工业菌株的遗传改造提供了一种新的、高效的转化手段。