结核分枝杆菌中O-甘露糖基化蛋白功能的研究进展

蛋白质的O-甘露糖基化修饰不仅在真菌和哺乳类细胞中广泛存在,在原核生物中例如分枝杆菌属、棒状杆菌属和链霉菌属中也存在,尤其在引起人类疾病的结核分枝杆菌中研究最多。许多O-甘露糖基化蛋白在结核分枝杆菌毒力以及与宿主相互作用过程中发挥了重要作用。本文就结核分枝杆菌中O-甘露糖基化蛋白生物学功能的进展加以综述。     

放线菌蛋白O-甘露糖基化的研究进展

蛋白质糖基化作为一种翻译后修饰方式不仅在真核生物中广泛存在,而且在原核生物中尤其是放线菌中也存在。本文针对放线菌中的分枝杆菌属、链霉菌属和棒状杆菌属存在的O-甘露糖基化蛋白的聚糖链结构、糖基化过程以及生物学意义加以论述。     

利用伴刀豆球蛋白检测O-甘露糖基化

目的:基于伴刀豆球蛋白A(ConA)特异性识别并结合甘露糖的特性,建立一种检测O-甘露糖基化的方法,为酵母等宿主表达蛋白的O-糖基化提供一种高效筛选和分析的方法。方法:利用糖苷酶F(PNGF)切除检测蛋白的N-糖链,排除N-糖基化的干扰;通过Q阴离子交换柱和ConA Sepharose 4B柱纯化Western印迹膜封闭蛋白牛血清白蛋白(BSA),除去BSA中甘露糖修饰的蛋白的干扰,优化膜封闭条件;利用辣根过氧化物酶标记的ConA检测具有低甘露糖型N-糖基化修饰能力的毕赤酵母GJK01-HL(Δoch1)表达的抗Her-2抗体是否存在O-甘露糖基化现象。结果:通过PNGF酶切处理,可以完全去除糖蛋白的N-糖链的干扰;BSA经过Q阴离子交换柱和ConASepharose 4B柱纯化后,除去了大部分甘露糖蛋白,可作为封闭蛋白;用建立的方法检测,发现毕赤酵母工程菌GJK01-HL(Δoch1)表达的抗Her-2抗体存在O-甘露糖基化现象。结论:本方法是研究糖蛋白是否发生O-甘露糖基化的有效检测手段,可用于酵母等表达蛋白的O-糖基化的高效筛选和分析。     

肽聚糖脱乙酰酶Rv1096对分枝杆菌与宿主细胞相互作用的影响

目的探讨结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis, Mtb)肽聚糖脱乙酰酶Rv1096对分枝杆菌与宿主细胞相互作用的影响。方法利用过表达Rv1096基因的重组耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis, MS)_Rv1096,通过差速离心及胰蛋白酶消化试验,确定Rv1096蛋白的亚细胞定位;通过氨基酸定点突变联合伴刀豆凝集素A(Concanavalin A, ConA)免疫印迹确定Rv1096的O-甘露糖基化位点;运用刃天青显色法检测MS_Rv1096对溶菌酶的抵抗力;通过巨噬细胞感染试验,分析了Rv1096对耻垢分枝杆菌细胞内存活能力和宿主细胞炎症应答的影响。结果确定了Rv1096在重组耻垢分枝杆菌MS_Rv1096中的亚细胞定位在细胞壁;发现Rv1096蛋白含有三个O-甘露糖基修饰位点(~(265)Thr,~(266)Ser,~(267)Ser);细胞外测试结果表明,Rv1096能增强耻垢分枝杆菌对溶菌酶的抵抗能力,最低抑菌质量浓度从1.5 mg/mL升至2.5 mg/mL,而细胞感染显示其并不能显著增强耻垢分枝杆菌在人单核细胞白血病细胞(THP-1细胞)内的存活能力;定量PCR检测结果显示,过表达Rv1096的耻垢分枝杆菌刺激THP-1细胞分泌炎症因子(TNF-α,IL-6和IL-1β)的能力显著下降。通过平行对比证明若删除O-甘露糖基化位点(~(265)Thr,~(266)Ser,~(267)Ser),对Rv1096基因功能无显著影响。结论 Rv1096是一个细胞壁相关蛋白,具有三个O-甘露糖基化位点。过表达Rv1096对耻垢杆菌在宿主细胞内的存活能力无显著影响,但能够降低宿主细胞对耻垢分枝杆菌的炎症因子应答,且上述功能不受O-甘露糖基化修饰影响。     

大肠杆菌O141 O-抗原基因簇的破译及进化分析

对大肠杆菌O141 O-抗原基因簇进行测序,序列全长15601bp,用生物信息学的方法进行序列分析,共发现12个基因：鼠李糖合成酶基因(rmlB,rmlD,rmlA,rmlC)、甘露糖合成酶基因(manB,manC),糖基转移酶基因(orf6,orf7,orf9,orf10)、O-抗原转运酶基因(wzx)和O-抗原聚合酶基因(wzy)。用PCR的方法筛选出了针对大肠杆菌O141的特异基因,可以用于基因芯片或PCR方法对大肠杆菌O141的快速检测。通过对大肠杆菌O141的O-抗原基因簇及甘露糖和鼠李糖合成酶基因的进化分析发现：大肠杆菌O141 O-抗原基因簇是低GC含量的片段,仅O-抗原特异的基因才出现在O-抗原基因簇;并且这些基因可能介导了O-抗原基因簇间的重组及以O141 O-抗原基因簇的形成。     

小球藻糖蛋白的分离、纯化和结构分析

采用柱层析分离纯化小球藻糖蛋白,并对其进行结构分析。结果表明,小球藻糖蛋白为白色粉末,产率为鲜藻的0．28％,易溶于水,分子量约为65,000Da,属O-连接方式,蛋白质含量为12．01％,糖链部分含有岩藻糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖。     

植物凝集素串联法富集纯化血清多个亚糖蛋白质组

蛋白质糖基化修饰是哺乳动物中最为常见的一种翻译后修饰,蛋白质的寡糖侧链具有重要的生物学意义,如蛋白质分子间及细胞间相互作用、识别、肿瘤侵袭与转移等.本实验应用寡甘露糖型亲合层析柱、唾液酸型层析柱和O-连接糖蛋白亲合层析柱从血清中序列性提取寡甘露糖型、唾液酸型的N-连接糖蛋白及O-连接的糖蛋白,一维和二维电泳图谱显示血清...     

α-甘露糖苷酶的研究进展

α-甘露糖苷酶(α-mannosidase,α-Man)是真核生物蛋白质N-聚糖修饰的关键酶,其对甘露糖残基的修剪过程是糖蛋白N-糖链复杂化的必要步骤,对蛋白质的合成及正确构象的折叠起决定性作用。N-聚糖的修饰过程包括高甘露糖的修饰与复杂型甘露糖合成两种,α-Man同时参与这两种修饰过程,并发挥重要作用。现重点介绍α-Man的分类、α-Man与高甘露糖修饰的关系、α-Man与复杂型甘露糖合成的关系及α-Man的应用,以期为后续研究提供理论依据。     

真核生物α-甘露糖苷酶生物信息学分析

α-甘露糖苷酶(α-mannosidase,α-Man)是真核生物蛋白质N-聚糖修饰的关键酶,其对甘露糖残基的修剪过程是糖蛋白N-糖链复杂化的必要步骤,对蛋白质的合成及正确构象的折叠起决定性作用。根据α-Man的功能特异性,其一般被分为糖基水解酶38家族(glycosyl hydrolase 38 family,GH38)、糖基水解酶47家族(glycosyl hydrolase 47 family,GH47)两个家族。利用生物信息学分析GH38家族与GH47家族在进化上的关系和氨基酸序列保守性以及不同物种内质网Ⅰ型甘露糖苷酶(endoplasmic reticulum ManⅠ,ERManⅠ)的理化性质、结构特点、功能特征后发现,GH47家族比GH38家族在进化上更早且保守性更好;α-Man基因在不同物种中长度存在明显差异,物种越高等基因平均长度越长;真核生物ERManⅠ均为亲水性不稳定蛋白质,其氨基酸序列存在跨膜螺旋并含有信号肽,且蛋白质空间构像为桶状,包含Ca~(2+)结合位点。文中对α-Man的生物信息学分析可以为研究α-Man在生命过程中的作用提供重要的信息。     

甘露糖筛选体系及在转基因玉米商业化中的应用

甘露糖在己糖激酶的作用下形成6-磷酸甘露糖,进一步在磷酸甘露糖异构酶(Phosphomannose isomerase,PMI)的催化下转化成植物可利用的6-磷酸果糖,从而使转化细胞在甘露糖作为主要碳源的培养基上正常生长,而非转化细胞生长受到抑制。这一筛选体系被认为是一种正向筛选(Positive selection),已被成功地应用于重要的粮食作物和经济作物中。甘露糖筛选的植株可以通过多种方法检测,其中氯酚红检测法和试纸条检测法简单方便,适用于初步筛选。甘露糖筛选体系安全高效,已被应用于玉米商业化产品中。综述了甘露糖(mannose)筛选体系的原理、筛选特点、植株的鉴定、筛选方法的优缺点以及在商业化中的应用,列举了利用甘露糖筛选的玉米单性状转化系用于抗鳞翅目和抗鞘翅目昆虫及抗高温淀粉酶的范例及其在育种叠加中的应用。这种育种叠加使得甘露糖筛选的性状与其他性状重叠而得到更广谱的具有抗除草剂抗虫性状的商业化产品。     

链霉菌来源D-甘露糖异构酶的性质及其在制备D-甘露糖中的应用

【背景】D-甘露糖具有多种功能活性,在食品、医药、饲料等行业应用广泛。D-甘露糖异构酶可以催化D-果糖与D-甘露糖之间的相互转化,在D-甘露糖的酶法制备中具有应用潜力。【目的】克隆一个链霉菌(Streptomycessp.)来源的D-甘露糖异构酶基因(ssMIaseA)并在大肠杆菌中表达,研究其酶学性质,并用于制备D-甘露糖。【方法】从链霉菌(Streptomycessp.)中发掘一个D-甘露糖异构酶基因(ssMIaseA),构建重组表达质粒pET-28a-ssMIaseA并在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,经Ni-NTA亲和层析纯化后测定酶学性质,利用高效液相色谱对SsMIaseA制备D-甘露糖进行研究。【结果】SsMIaseA与嗜热裂孢菌(Thermobifda fusca)来源的D-甘露糖异构酶ManI相似性最高,为60.2%。该酶比酶活为525 U/mg,分子量约为45 kD,最适pH和温度分别为7.5和45°C,在pH 6.5-10.0范围内和45°C以下保持稳定。该酶对甘露糖具有最高催化活性,其次是果糖、塔罗糖和塔格糖。利用SsMIaseA转化600 g/L D-果糖,反应8 h达到平衡,生成185 g/L D-甘露糖,转化率为31%。【结论】SsMIaseA作为新型D-甘露糖异构酶为D-甘露糖的酶法制备奠定了基础。     

酵母N-糖基化工程研究进展

酵母表达系统可用来生产具生物活性的重组糖蛋白,但其在N-糖基化过程中会生成高甘露糖型糖链。通过引入相关的甘露糖苷酶和糖基转移酶基因、切断酵母自身的高甘露糖链形成通道能够改变酵母宿主N-糖基化的类型。本对酵母N-糖基化工程的研究状况、最新进展及存在问题作简要阐述。     

植物乳杆菌黏附大鼠小肠黏液及机制的研究

分析了6种植物乳杆菌黏附大鼠小肠粘液的能力,并分析了介导黏附性的主要因素。结果表明,植物乳酸杆菌向大鼠小肠粘液的黏附具有菌种特异性,其黏附作用是甘露糖特异性的,细胞外表蛋白质、碳水化合物和(脂)磷壁酸可能参与了黏附过程。     

鲍曼不动杆菌碳青霉烯耐药性与生物膜形成及O-甘露糖蛋白相关性研究

鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii)是引起医院感染的常见致病菌,该细菌不仅容易产生耐药性,而且在人体及无生命物质表面易形成生物膜,临床治疗较为棘手。从临床分离24株鲍曼不动杆菌,药物敏感试验观察这些分离株对常用抗菌药物的敏感性,针对耐碳青霉烯鲍曼不动杆菌,检测是否含有耐药基因碳青霉烯酶基因OXA-23,采用结晶紫染色法观察耐药性与生物膜形成的相关性,并用刀豆蛋白凝集素结合试验及质谱分析耐药性与O-甘露糖蛋白的相关性。结果显示鲍曼不动杆菌耐药性与生物膜形成呈正相关,某些O-甘露糖蛋白表达有利于细菌获得耐药性。     

MBP基因突变与感染性疾病的关系的研究进展

甘露糖结合蛋白(MBP)是一种Ca^2 依赖性C型凝集素,由肝脏分泌,可与甘露糖丰富的病原体表面及巨噬细胞上特异性的受体结合,可识别大多数G^—和G^ 细菌及病毒、真菌等,发挥调理素及诱导巨噬细胞的作用,并能激活补体,导致病原体裂解。亦可清除循环免疫复合物。人MBP基因突变,干扰MBP的二级结构,产生无功能的蛋白质,引起血清MBP水平低下和调理缺陷,减弱细胞吞噬作用。研究表明,MBP基因突变与病毒性用：炎、肝硬化及肝癌以及HIV、细菌感染均有一定的相关性。     

刺参甘露糖结合凝集素的生物信息学分析

甘露糖结合凝集素(mannan-binding lectin,MBL)属于C型动物凝集素超家族,特异地结合甘露糖。MBL是宿主起始免疫系统一个重要成分,因此近年来逐渐成为研究的热点。采用生物信息学技术对刺参(Apostichopus japonicus)MBL(AJ-MBL)的两个基因编码的蛋白质结构和功能进行了分析,包括信号肽、分子量、等电点、跨膜结构域、糖基化和磷酸化位点、二级结构和三级结构等,旨在了解其结构特征,为动物免疫反应方面研究提供理论基础。     

基于D-甘露糖和葡萄糖含量的白木通种质资源评价

本研究以D-甘露糖和葡萄糖含量作为定点评价指标对白木通种Akebia trifoliata(Thunb.)Koidz.var.australis(Diels)Rehd.质资源进行评价,筛选葡萄糖含量/D-甘露糖含量(C 葡/C甘)比值较低且稳定的白木通种质.采用RP-HPLC系统检测白木通不同种质果皮中的D-甘露糖和葡萄糖含量.研究结果表明,在两年的同一区域试验点和不同区域试验点上白木通种质'黔通1号'的D-甘露糖含量均表现最高,C葡/C甘比值均较低,但各个区域试验点的结果差异较大,达到显著及极显著水平;白木通种质'黔通2号'和'黔通3号'的D-甘露糖和葡萄糖含量在同一试验点和不同试验点上呈不稳定状态.三份白木通种质D-甘露糖和葡萄糖含量受环境因子的影响大于其自身遗传因子的影响,'黔通1号'种质D-甘露糖和葡萄糖代谢遗传稳定性较'黔通2号'和'黔通3号'种质稳定,适合作药用种质加以推广.     

铁皮石斛甘露糖结合凝聚素的分子建模与对接研究

本文通过序列分析获得了铁皮石斛甘露糖结合凝聚素(Dendrobium officinale mannose-binding lectin,DOL)成熟肽和甘露糖结合位点(50-58AA,81-89AA,116-124AA)。通过同源建模建立了DOL三维结构模型,DOL呈中空的三棱柱结构,三棱柱的三个侧面主要由β折叠构成,三个侧面各有一个甘露糖结合部位。甘露糖与DOL的分子对接和动力学分析表明,结合位点50-58AA和81-89AA对甘露糖的结合要强于116-124AA,在与甘露糖结合的过程中发挥关键作用的氨基酸残基为Gln81,Asp83,Asn85和Tyr89。研究结果有助于进一步开展凝集素抗病机理及凝集素相关药物研究。     

丝状真菌糖生物学

蛋白质的糖基化修饰是一种保守的真核生物蛋白质翻译后修饰,存在于从酵母到人的所有真核生物中,赋予了蛋白质功能的多样性。目前对蛋白质糖基化修饰的了解主要来源于对酵母和哺乳动物细胞的研究,但单细胞真核生物或动物细胞水平的研究,很难反映糖基化修饰在多细胞真核生物的发育分化过程中的复杂功能。由于丝状真菌是多细胞真核生物,有相对简单的发育分化过程,因而是研究多细胞真核生物糖基化功能的理想模型之一,在过去10年中,丝状真菌的糖生物学研究开始受到重视,目前的研究结果表明糖基化修饰与丝状真菌的生长、发育密切相关。     

古菌蛋白质修饰研究进展

20世纪50年代中期,在古菌的表层(S-层)首次发现了糖蛋白;21世纪初又在空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)中发现了蛋白质N-糖基化修饰。由此,同行开始认识到,蛋白质的糖基化修饰广泛存在于古菌、细菌及真核生物三域中。近十年来,古菌蛋白质糖基化修饰的研究取得了进展,特别是古菌蛋白质N-糖基化修饰研究进展快速。但对古菌糖蛋白O-糖基化修饰和脂修饰的了解甚少。本文综述了古菌蛋白质糖基化修饰的研究进展。