一种新型的CRISPR/Cas9-hLacI双链DNA供体适配基因编辑系统

在CRISPR/Cas9系统介导的基因编辑中,借助于双链DNA （double-stranded DNA,dsDNA）供体模板的重组效应能够实现对目标基因组靶位点的精确编辑和基因敲入,然而高等真核生物细胞中同源重组的低效性限制了该基因编辑策略的发展和应用。为提高CRISPR/Cas9系统介导dsDNA供体模板的同源重组效率,本研究利用大肠杆菌（Escherichia coli）乳糖操纵子阻遏蛋白LacI与操纵序列LacO特异性结合的特点,通过重组DNA技术将密码子人源化优化的阻遏蛋白基因LacI分别与脓链球菌（Streptococcus pyogenes）源的SpCas9和路邓葡萄球菌（Staphylococcus lugdunensis）源的SlugCas9-HF融合表达,通过PCR将操纵序列LacO与dsDNA供体嵌合,构建了新型的CRISPR/Cas9-hLacI供体适配系统（donor adapting system,DAS）。首先在报告载体水平上对Cas9核酸酶活性、DAS介导的同源引导修复（homology-directed repair,HDR）效率进行了验证和优化,其次在基因组水平对其介导的基因精确编辑进行了检测,并最终利用CRISPR/SlugCas9-hLacI DAS在HEK293T细胞中实现了VEGFA位点的精确编辑,效率高达30.5%,显著高于野生型。综上所述,本研究开发了新型的CRISPR/Cas9-hLacI供体适配基因编辑系统,丰富了CRISPR/Cas9基因编辑技术种类,为以后的基因编辑及分子设计育种研究提供了新的工具。     

利用CRISPR/Cas9技术构建基因编辑大鼠模型

RNA介导的CRISPR/Cas9基因编辑系统由单链引导RNA(sgRNA)与核酸酶Cas9构成。在细胞内,sgRNA能够按照碱基互补配对的原则引导Cas9与靶点结合,由Cas9切割目标DNA,造成双链DNA断裂(double stranded break, DSB)。在随后的DNA修复过程中,细胞主要进行非同源末端连接(non-homologous end joining,NHEJ)或在有修复模板存在的情况下进行重组修复(homology directed repair, HDR)。如果将CRISPR/Cas9系统以及修复模板通过显微注射的方式导入大鼠的胚胎内,就能借助细胞的修复机制实现大鼠胚胎的基因编辑,由此构建各种基因修饰大鼠模型。本文详细介绍了利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建大鼠模型的具体操作步骤,以期为相关领域的科研人员提供一种大鼠基因修饰模型的构建方法。     

CRISPR/Cas9技术在生物医学领域的非病毒及病毒载体

规律成簇的间隔短回文重复序列(CRISPR)及CRISPR相关蛋白9(CRISPR/Cas9)系统是一种新型基因组编辑技术,能够靶向干扰或修复基因组的特定基因.来自细菌或人工改造的CRISPR/Cas9系统已经由生物学家发现或构建,Cas9核酸酶及单链导向RNA(sgRNA)是CRISPR/Cas9系统的主要组成成分.该系统被广泛应用于疾病治疗新靶点的发掘,基因功能的鉴定,动物模型的建立以及基因治疗药物的开发.CRISPR/Cas9系统已经通过突变或修正疾病相关基因来部分缓解或彻底治愈某些病症.然而,如何有效递送CRISPR/Cas9至目标细胞及靶器官仍然是运用该技术所面临的挑战之一,这影响着该系统稳定和精准的基因编辑能力.本文主要综述Cas9mRNA,Cas9蛋白或编码Cas9基因及相应sgRNA载体的递送系统.递送Cas9蛋白的非病毒载体能够维持Cas9的靶向作用,减少脱靶效应;递送sgRNA和供体模板的病毒载体能够改进基因编辑及同源修复效率.安全,有效及可规模化生产的递送载体将会推进CRISPR/Cas9技术在人类基因治疗领域中的应用.     

利用CRISPR/Cas9和piggyBac实现果蝇基因组无缝编辑

CRISPR/Cas9 (clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated protein9)是第三代基因组编辑技术。在sgRNA引导下,Cas9核酸内切酶作用于特定基因组序列,产生DNA双链断裂(double-strandedbreaks,DSBs),利用同源定向修复(homology-directedrepair,HDR)可实现对靶基因的特异性基因敲除(knock-out)或敲入(knock-in)。传统的技术方案将CRISPR/Cas9技术与Cre/loxP或FLP/FRT系统联用,可实现高效的基因打靶,也易于移除打靶过程中引入的筛选标记。然而,筛选标记移除过程中会在基因组中残留34个碱基的标签序列。因此,对基因组进行精确编辑的同时不引入无关序列仍有一定难度。在人工诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells, iPSCs)的基因组编辑中,CRISPR/Cas9技术和piggyBac转座酶联用的两步法策略能够实现这一目标:首先运用CRISPR/Cas9技术,利用同源定向修复原理引入基因突变及筛选标记,然后利用piggyBac转座酶将筛选标记精确移除。借鉴该方法的技术原理,本研究对果蝇(Drosophila melanogaster)CG4894基因进行了无缝编辑(seamless genome editing),成功将该基因第18外显子上第21位的酪氨酸(tyrosine,Y)突变为半胱氨酸(cysteine,C),且测序结果显示基因组中除设计位点之外并无其他外源序列残留。CRISPR/Cas9技术和piggyBac转座酶联用策略为果蝇基因组的精确编辑提供了更多选择。     

基于CRISPR/Cas9基因编辑技术的人类遗传疾病基因治疗相关研究进展

CRISPR/Cas9系统(常间回文重复序列丛集/常间回文重复序列丛集关联蛋白系统)为靶向基因编辑提供了强大的技术手段.利用序列特异性sgRNA的引导,CRISPR/Cas9系统能够精准地在目标DNA的确切位置导入双链切口.与已有的基因编辑手段相比,该系统具有更优异的简便性、特异性和有效性.目前,大量涉及体内外多物种的CRISPR/Cas9基因编辑研究已充分展示了该技术的巨大潜力,为基于该技术的疾病治疗研究和临床应用带来了希望.基于CRISPR/Cas9基因编辑技术所介导的非同源性末端连接和同源性DNA修复作用,近期多个研究工作已经成功应用该技术修复了包括点突变和基因组缺失等在内的遗传疾病相关基因组缺陷.本综述将总结近期有关利用CRISPR/Cas9基因编辑技术治疗人类遗传性疾病的相关临床前研究进展.     

CRISPR/Cas9系统的发展及其在动物基因编辑中的应用 *

CRISPR/Cas9作为一种新型的基因编辑技术,主要在DNA水平对生物体的遗传信息进行修改,具有强大的基因编辑能力,目前已经被广泛应用于多个领域,包括基因功能研究、构建动物模型、家畜新品种的培育以及基因治疗等。CRISPR/Cas9技术的不断发展为生物学及医学领域的研究带来了革命性的突破,利用该技术构建基因突变小鼠有助于基因功能的研究,对于遗传疾病的治疗等具有重要的参考价值,同时还可以从基因组水平上有效改善家畜动物的生产性能,提高家畜动物的抗病能力。主要介绍了CRISPR/Cas系统的研究历程、结构与分类,详细阐述了CRISPR/ Cas9技术的作用机制及其在动物基因编辑中的应用,探讨了CRISPR/Cas9在基因编辑动物的制备中存在的问题及优化策略,并对其发展前景进行了展望。     

人类胚胎单碱基编辑治疗遗传疾病的研究

基因编辑技术是当今生物学研究领域最为重要的颠覆性技术之一,以CRISPR/Cas9系统为核心的基因编辑工具被广泛应用于包括人类体细胞、生殖细胞编辑相关的医学研究领域。虽然CRISPR/Cas9系统可以高效编辑靶基因,但其精准编辑能力依赖于效率极低的同源重组方式,这极大限制了其定点编辑的能力与应用范围,所以寻找一种能高效引入点突变的新型基因编辑工具具有重大的应用价值。以CRISPR/Cas9系统为基础的单碱基编辑系统可以在基因组靶位点实现精准、高效的C/G和T/A碱基间的转换,其编辑能力已经在动植物、人体细胞以及人类胚胎中得到证实。利用单碱基编辑技术,有望对人类超过70%的相关遗传性致病位点进行修复。现就人类胚胎单碱基编辑治疗遗传疾病的最新研究进展进行综述和展望。     

基于CRISPR/Cas9技术的基因敲入/敲除策略

成簇的规律间隔性短回文序列(CRISPR)基因编辑系统,因其设计简单操作方便和无种属限制,已成为一种广泛应用的基因组定点编辑工具,在复杂的基因组编辑,例如基因的人源化改造以及条件等位基因的构建中有所应用。在自然界中,CRISPR系统拥有多种类别。其中,CRISPR/Cas9系统是研究最深入、应用最成熟的一种。本文针对CRISPR/Cas9系统,分别从基因敲入/敲除片段的大小、同源臂长短、构型即递送方式等技术环节进行综述,阐述不同设计及操作条件下由CRISPR/Cas9系统介导的基因敲入/敲除的效率差异。     

利用CRISPR/Cas9技术对人多能干细胞进行高效基因组编辑

CRISPR/Cas9技术提供了一个全新的基因组编辑体系。本文利用CRISPR/Cas9平台,在人胚胎干细胞株中对选取的一段特定基因组区域进行了多种基因组编辑：通过在基因编码框中引入移码突变进行基因敲除;通过单链DNA提供外源模板经由同源重组定点敲入FLAG序列;通过同时靶向多个位点诱导基因组大片段删除。研究结果表明CRISPR/Cas9可以对多能干细胞进行高效基因编辑,获得的突变干细胞株有助于对基因和基因组区域的功能进行分析和干细胞疾病模型的建立。     

CRISPR/Cas9单碱基编辑技术创制抗除草剂拟南芥种质

正CRISPR/Cas9基因编辑系统因其高效、廉价、简单、通用等特点,引发了基因编辑领域的革命.但是,在植物基因组上进行定点突变,依然困难重重.目前的技术路线是,将含有突变的DNA模板通过修复Cas9产生的DNA双链断裂的方式整合到植物基因组中,从而实现目标区域中的点突变.整合机制包括同源末端修复~([1])或非同源末端修复~([2])的两种方式.但是,DNA模板整合到目标区域的效率极低,这是在植物基因组中     

主编导读

<正>本期主编导读主题:碱基编辑、脑细胞芯片、超高通量筛选、微量磷酸化蛋白质富集等技术方法,以及疫苗抗体、多肽药物、治疗用酶、生物材料、生物合成等领域的新进展。1技术方法以CRISPR/Cas9基因编辑系统为代表的基因组编辑技术可以显著提高基因敲除及定点修饰的效率。传统的CRISPR/Cas9技术通过在靶点处产生DNA双链断裂,诱发细胞内的同源重组和非同源末端连接修复途径,进而实现对基因组DNA的定点敲除、替换、插入等修饰。     

动物基因组编辑中提升CRISPR/Cas9介导的同源重组效率研究进展*

基因组编辑技术可以对DNA或RNA进行精准改造,极大地促进了生命科学的发展。CRISPR/Cas9系统在靶位点诱导DNA发生双链或单链损伤,细胞对损伤部位采用无供体模板的非同源末端连接(non-homologous end joining,NHEJ)或有供体模板的同源重组(homologous recombination,HR)修复。基于HR的基因组编辑策略通常被用于获得DNA的精准改造,而NHEJ在动物DNA损伤修复中起主导作用。为了提升HR效率,研究人员设计了多种方案,包括CRISPR/Cas9系统优化和DNA修复通路调控等。从DNA损伤修复途径、Cas9变体选择、sgRNA设计、供体模板设计、DNA修复途径相关蛋白功能调控、供体模板募集效率提升、细胞周期调控及编辑细胞生存效率提升等方面详细综述了相关研究成果,发现尚未开发出放之四海而皆准的HR提升策略,基于HR的基因组编辑需要针对具体案例制定个体化策略。旨在为动物基因组编辑中提升CRISPR/Cas9介导的HR效率研究提供理论参考,为动物基因功能分析、基因治疗和经济动物基因编辑育种提供帮助。     

CRISPR/Cas9技术及其在转基因动物中的应用

CRISPR/Cas9技术是一种新型的基因组定点编辑技术,具有设计简单、特异性强、效率高及可以在目标位点产生多种类型的编辑结果等特点,适用于在多种细胞中进行大规模的基因编辑。综述了CRISPR/Cas9技术的研究背景、基本原理和研究进展,从靶基因敲除(knock-out)、外源基因整合(knock-in)和目标基因转录沉默(knock-down)等方面总结了CRISPR/Cas9在转基因动物中的应用概况,并对现有的三种基因组定点编辑技术进行了比较。CRISPR/Cas9技术在转基因动物中具有明显的应用优势和良好前景。     

基于CRISPR/Cas9的精准基因编辑技术研究进展

基因编辑技术是一种可以在基因组水平上对DNA序列进行改造的遗传操作技术。基于CRISPR/Cas9系统的精准编辑技术是一个操作方便、应用广泛的基因编辑技术,与传统的CRISPR/Cas9不同,精准基因编辑技术可以在不需要DNA模板的情况下对基因进行定点突变。本文重点介绍了近年来基于CRISPR/Cas9介导的精准基因编辑技术的发展,并深入分析了基因精准编辑技术面临的挑战和机遇。     

缺口酶Cas9 D10A和Cas9 H840A在大肠杆菌基因组编辑中的应用

目前Ⅱ型CRISPR/Cas9工具被广泛应用于基因组编辑中,利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术对大肠杆菌(Escherichia coli)基因组进行编辑,可应用于代谢工程及细菌耐药性等研究领域中。利用单缺口核酸酶Cas9 nickase (Cas9n)工具对宿主细胞基因进行修饰,可降低由于双链断裂对宿主带来的毒性。但目前利用CRISPR/Cas9n对大肠杆菌基因组编辑的研究较少,不利于缺口酶Cas9 D10A和Cas9 H840A在大肠杆菌基因组编辑的应用。本研究在前人报道的细菌双质粒Cas9基因编辑系统(pCas/pTarget)基础上,通过分子突变的方法构建缺口酶Cas9突变体质粒pCas-D10A和pCas-H840A,以及携带修复模板或无修复模板的靶向大肠杆菌sseA基因的质粒pTargetT-△sseA(993 bp)和pTargetT-△sseA,系统研究了两种缺口酶编辑大肠杆菌内源性基因sseA的有效性和效率。在稳定表达pCas质粒的MG1655菌株中转入携带修复模板的pTargetT-△sseA(993 bp)质粒,通过菌落PCR及DNA测序方法验证基因编辑的有...     

CRISPR/Cas9的应用及脱靶效应研究进展

CRISPR/Cas9基因编辑技术在生命科学领域掀起了一场全新的技术革命,该技术可以对基因组特定位点进行靶向编辑,包括缺失、插入、修复等。CRISPR/Cas9比锌指核酸酶 (ZFNs)和转录激活因子样效应物核酸酶(TALENs)技术更易于操作,而且更高效。CRISPR/Cas9系统中的向导RNA(Single guide RNA, sgRNA)是一段与目标DNA片段匹配的RNA序列,指导Cas9蛋白对基因组进行识别。研究发现,设计的sgRNA会与非靶点DNA序列错配,引入非预期的基因突变,即脱靶效应(Off-target effects)。脱靶效应严重制约了CRISPR/Cas9基因编辑技术的广泛应用。为了避免脱靶效应,研究者对影响脱靶效应的因素进行了系统研究并提出了许多降低脱靶效应的方法。文章总结了CRISPR/Cas9系统的应用及脱靶效应研究进展,以期为相关领域的工作提供参考。     

CRISPR/Cas9基因组编辑技术在癌症研究中的应用

CRISPR/cas9基因组编辑技术因其设计简单以及操作容易,使其在基因编辑的研究中越来越受到欢迎。利用该技术,科研人员可以实现在碱基的水平对基因组进行定点修饰。CRISPR系统现已经被广泛地应用到多个物种的基因组编辑以及癌症的相关研究中。本文在最新研究进展的基础上,结合对癌症研究及基因组编辑技术的理解,对CRISPR/Cas9技术在癌症研究中的应用进行了综述。     

利用CRISPR/Cas9基因编辑技术建立FcγR基因大片段敲除小鼠模型

目的使用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除长度约为90 kb的小鼠FcγR2b,FcγR3,FcγR4基因簇,为构建FcγR基因人源化小鼠奠定基础。方法使用在线预测软件在FcγR2b,FcγR3外显子区设计sgRNA,在每一位点挑选脱靶效应较低的五个候选sgRNA。通过CRISPR/Cas9活性检测试剂盒检测sgRNA在体外的活性。选取活性较高的sgRNA体外转录,与Cas9 mRNA一并注射受精卵。通过PCR检测及测序,得到1只敲除片段为89 711 bp的基因修饰小鼠,且同时敲除FcγR2b基因5’端,FcγR3基因3’端及FcγR4基因。而且还利用软件预测了8个脱靶可能性最高的位点,并对首建鼠基因组的上述8个脱靶位点全部测序确认。结果结果显示未在预测脱靶位点附近发现小片段插入或缺失。结论建立了利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除基因组超大片段的技术,该技术结合BAC转基因技术,将为建立含有复杂基因族的人源化小鼠提供新的途径。     

CRISPR/Cas9技术存在的问题及其改进措施的研究进展

CRISPR/Cas9技术是一种RNA引导的基因组编辑技术,能对基因进行精确性敲除、敲入、替换等,从而实现探究基因功能、修复致病基因等目的。该技术凭借操作简便、价格低廉、可对基因位点进行编辑、可拓展性强等优势,在近几年迅速发展完善,已成为继锌指核酸酶技术和类转录激活因子效应物核酸酶技术之后的第三大基因组编辑技术。在简单介绍CRISPR/Cas9技术的作用机制后,主要针对该技术现阶段面临的精确修复比例低、PAM限制识别序列、脱靶现象、马赛克现象的问题以及相应的改进措施进行阐述,旨在让研究者客观的认识CRISPR/Cas9技术存在的不足之处,为合理使用或改进该技术提供系统的文献综述。