超级杂交水稻 TIR1 类似基因 cDNA 的克隆与生物信息学分析

生长素受体TIR1通过形成SCFTIR1复合体与生长素直接结合, 即为Aux/IAA在26S 蛋白酶体降解过程中的关键蛋白质。在Blas t检索和生物信息学分析的基础上设计特异引物, 以超级杂交水稻(Oryz a sativa)亲本株1S为材料, 通过RT-PCR扩增并经T-A克隆后测序, 获得一条长度为2 219 bp 的序列, 其开放阅读框长度为1 764 bp, 编码含587个氨基酸残基的肽链。该序列经生物信息学分析发现, 其与拟南芥TIR1相似性为77%, 同样具有2个保守的结构域, 即F-box和亮氨酸富集重复区域(LRR),且都不具有跨膜结构域和信号肽。该cDNA序列命名为OsTIR1。     

超级杂交水稻TIR1类似基因cDNA的克隆与生物信息学分析

生长素受体TIR1通过形成SCFT。刚复合体与生长素直接结合,即为Aux／IAA在26S蛋白酶体降解过程中的关键蛋白质。在Blast检索和生物信息学分析的基础上设计特异引物,以超级杂交水稻（Oryza sativa）亲本株1S为材料,通过RT-PCR扩增并经T-A克隆后测序,获得一条长度为2219bp的序列,其开放阅读框长度为1764bp,编码含587个氨基酸残基的肽链。该序列经生物信息学分析发现,其与拟南芥TIR1相似性为77％,同样具有2个保守的结构域,即F—box和亮氨酸富集重复区域（LRR）,且都不具有跨膜结构域和信号肽。该cDNA序列命名为OsTIR1。     

水稻硒结合蛋白基因OsSBP的克隆、表达及生物信息学分析

为了探究水稻硒结合蛋白(selenium-binding protein, SBP)基因的功能,以水稻品种日本晴(Oryza sativa Japonica)为材料,采用同源克隆法获得Os SBP,并对其进行组织特异表达及生物信息学分析。结果表明,Os SBP基因cDNA序列为1 623 bp,包括长度为1 449 bp的CDS,碱基组成为A 23.3%、T 25.1%、G 28.9%、C 22.6%,编码482个氨基酸残基组成的蛋白质。Os SBP蛋白表现为弱酸性,且稳定、亲水;二级结构中以无规则卷曲和延伸链结构为主,三级结构同源建模成功,主要是螺旋和转角;亚细胞定位Os SBP主要分布在细胞质中,推测可能在运载结合、辅助因子中发挥重要作用,无跨膜结构域,无信号肽;该蛋白序列中存在24个丝氨酸磷酸化,11个苏氨酸磷酸化位点和10个酪氨酸磷酸化位点以及6个糖基化位点。启动子元件分析表明,其含有与热胁迫、干旱胁迫、光反应、细胞防御、赤霉素(GA)和茉莉酸甲酯(MeJA)信号传导相关元件。进化分析结果表明,克隆的Os SBP氨基酸序列与短柄草、高粱的同源关系较近,具有较高的保守性,与莱茵衣藻的同源关系较远。RT-PCR分析结果表明,Os SBP基因在各组织中均有表达,水稻孕穗期中茎的表达最高,其次分别为叶和根,穗中表达量最低,且该基因的表达受Cd,盐和热的诱导,以及PEG和Cold的抑制。该基因的成功克隆及分析为进一步研究Os SBP在水稻抗逆中的作用奠定了重要的基础。     

水稻纹枯病菌Rspg1基因的克隆、表达及其编码产物生物信息学分析

【目的】为克隆、表达水稻纹枯病菌Rspg1基因,明确其编码产物的生物学特性,为研究该基因在病菌致病过程及与寄主互作中的作用提供理论依据。【方法】据GenBank提供的相关序列设计特异引物扩增目的基因,并对之进行原核表达和生物信息学分析。【结果】从水稻纹枯病菌基因组DNA中扩增出一1395 bp的目的片段。RT-PCR分析表明,该片段为Rspg1基因的完整开放阅读框,含有5个内含子(278-334,57 bp;545-601,57 bp;657-715,59 bp;1090-1155,66 bp;1244-1304,61 bp),编码区为1 095 bp,编码一含有364个氨基酸的蛋白。原核表达Rspg1基因,表达产物大小约为40 kDa,具明显的多聚半乳糖醛酸酶(Polygalacturonase,PG)活性,活性值为277.78 U/mg。生物信息学分析表明,RsPG1中含有所有生物PG特有的严格保计序列180NTD、202DD、223GHG和255RIK,存在一18个氨基酸的信号肽分子;二级结构以α-螺旋、β-折叠和随机卷曲为其基本结构单元,6个半胱氨酸残基形成3个二硫键,跨膜结构预测以从胞内向胞外分泌为主;三级结构为10个重复的β-折叠环按右手螺旋规则排列形成的螺旋结构,形成一个开放的有活性的裂隙结构。【结论】Rspg1基因编码产物为一40 kDa蛋白,具明显的PG(Polygalacturonase,PG)活性,以胞外分泌为主,且有一个开放的有活性的裂隙结构。     

家蝇抗菌肽Cecropin-His_6融合基因的克隆、序列分析及其表达载体构建

克隆家蝇幼虫抗菌肽Cecropin -His 6融合基因 ,构建其真核表达载体 ,为更深入的抗菌肽活性研究及制备新型肽类抗生素创造条件。该文从家蝇幼虫组织中提取总RNA ,RT -PCR扩增编码Cecropin开放阅读框cDNA序列 ,将其克隆至pUCm -T载体进行序列测定 ;然后用含 6×His标签序列的下游引物克隆Cecropin -His 6融合基因 ,并将其构建于真核表达载体pcDNA3.1( )中 ;同时应用生物信息学对融合基因的理化性质和二级结构进行预测分析。结果表明 ,RT -PCR扩增得到约 2 30bp的目的cDNA片段 ,与Genebank中报道的家蝇CecropincDNA序列存在一个无义变异差异 (Lys:AAG→AAA) ;6×His标签成功融合到Cecropin的C端。Cecropin -His 6融合基因的克隆和真核表达载体的成功构建 ,为进一步制备抗耐药菌的肽类抗生素奠定了基础。     

拟南芥AtNHX5基因的cDNA克隆及其正义、反义表达载体的构建

采用RT-PCR方法从拟南芥品种Landsberg的实生苗叶片中克隆AtNHX5基因的cDNA,核酸序列表明该基因编码区为1 554 bp,编码538个氨基酸.与GenBank发表的序列(AF490589)相比,有三处碱基不同,分别为850 bp处的G(GenBank的为A)、904 bp处的T(A)、985处的G(A).将该基因分别正向或反向置于CaMV35S启动子之后,可构建正义、反义表达载体.     

猪JARID1C基因的cDNA克隆、生物信息学及组织表达谱分析

JARID1C是高度保守的ARID蛋白家族的成员,该家族的蛋白参与并引起一系列生物学效应,如染色质重塑、细胞增殖与分裂、个体发育以及基因转录调控。JARID1C在人脑中表达丰富,对脑的发育和维持正常功能具有重要作用,突变可引起智力迟钝。本研究采用电子克隆（insilicocloning）的方法并结合5′末端快速扩增技术（RACE）,从猪卵巢中克隆到JARID1C的全长cDNA序列（GenBank登录号：EF139241）。猪JARID1C基因的cDNA全长5,908bp,包括4,551bp的开放阅读框（ORF）、522bp的5′非翻译区（5′UTR）和835bp的3′非翻译区（3′UTR）,polyA加尾信号序列AATAAA位于5,881bp和5,886bp之间。生物信息学分析揭示JARID1C蛋白含有1517个氨基酸残基,定位于细胞核中,该蛋白含有5个保守的结构域：JmjN结构域、ARID结构域、JmjC结构域、C5HC2锌指结构域和PHD锌指结构域。应用ClusterW程序分别对猪、狗、小鼠、大鼠、人和猿的JARID1C核苷酸序列和氨基酸序列进行多重序列比对,发现猪的JARID1C与其他哺乳动物具有很高的相似性。借助Mega3.1软件,采用N-J算法构建JARID1亚家族蛋白的系统进化树,揭示不同物种的进化关系。应用实时荧光定量PCR技术分析该基因在不同组织的表达差异,结果表明该基因在各组织均不同程度地表达,其中在肺和骨骼肌表达水平最低,而在脑和性腺表达水平最高。     

烟草NtCBL1基因的克隆、表达载体构建及表达分析

CBL是一类Ca²⁺感受蛋白,在植物适应或抵制逆境胁迫的过程中发挥重要的作用。从烟草品种K326中克隆到了一个CBL1的同源基因,该序列包含了一个642 bp的开放阅读框,编码一个由213个氨基酸残基组成的蛋白,预测分子量为24.5 kDa,等电点为5.03。同源性分析结果显示,该基因与林烟草CBL1、甜辣椒CBL1等具有较高的同源性,故命名为NtCBL1。生物信息学分析表明,NtCBL1具有CBL家族保守的EF-hand钙结合结构域。组织表达分析发现该基因在成熟期的根、茎、叶、花中均有表达,在根中的表达量最高。逆境胁迫实验表明,该基因表达受低钾、高盐、干旱、ABA和低温诱导调控,参与烟草生物与非生物逆境胁迫的响应。并成功构建了NtCBL1-pBI121过表达载体。研究结果为解析NtCBL1在响应逆境胁迫的功能奠定一定理论基础。     

人LRG1基因的原核表达及生物信息学分析

为了探讨LRG1基因结构与功能,对该基因进行克隆并构建到原核表达载体上,并对其进行表达及生物信息学分析。用Trizol法提取人肝癌HepG2细胞总RNA后,PCR扩增得到LRG1片段,经鉴定后将目的基因与原核表达载体pET28a连接,经诱导表达获得His-LRG1蛋白。LRG1基因cDNA片段大小为1 044 bp,编码347个氨基酸;成功构建pET28a原核表达载体,经多次不同条件诱导后,得到大小约40 kD目的蛋白;利用软件对LRG1蛋白的一级、二级结构进行了预测,分析总结得LRG1基因编码的蛋白是一个不稳定且具有亲水性的蛋白,可与多种信号开关相互作用。LRG1属于高度保守的富亮氨酸重复家族成员,其原核表达载体不易诱导产生大量目的蛋白,克隆表达该基因有利于验证其结构与功能关系。     

水稻钾离子通道基因OsKAT1.1的克隆、表达载体的构建及其电生理功能

K+通道是植物高效吸收和体内运输K+的载体,对保证植物的钾素营养和增强抗逆性具有重要意义.水稻生长在淹水环境中,其K+通道在长期适应物种立地条件的进化过程中可能形成了有别于拟南芥等模式植物的独特功能特征和作用机制.本研究克隆了一个水稻KAT型K+通道基因OsKAT1.1,并利用电生理技术探讨其电生理功能.研究结果表明,通过一系列亚克隆过程,我们成功构建了适用于双电极电压钳和膜片钳电生理研究的表达载体pCI-OsKAT1.1和pTracer-CMV3-OsKAT1.1.进一步的电生理试验结果验证了构建过程的准确性,并表明水稻OsKAT1.1是一个由膜电位控制的吸收型K+通道.     

芍药乙烯受体PlETR1基因过表达载体的构建及烟草转化

芍药是乙烯敏感型花卉,乙烯受体感知并传导乙烯信号,在乙烯信号转导途径中发挥重要作用。芍药PlETR1基因cDNA全长序列已分离,为了鉴定芍药PlETR1基因的功能,本研究基于PlETR1基因和表达载体序列,应用Primer Premier 5.0软件设计了一对特异性PCR引物,采用RT-PCR技术扩增出了PlETR1编码区片段,进一步构建了芍药PlETR1基因过表达载体。基于优化的模式植物烟草的组培体系和筛选出的潮霉素抗性浓度,应用农杆菌介导的叶盘法开展了芍药PlETR1基因转化烟草的研究,对转基因抗性烟草植株进行了PCR检测,结果表明HPT基因和芍药PlETR1基因已导入到烟草基因组中,且芍药PlETR1基因转录表达成功,为下一步鉴定芍药PlETR1基因的功能提供科学依据。     

水稻类受体蛋白激酶基因OsESG1的克隆与生物信息学分析

类受体蛋白激酶(receptor-like protein kinase,RLK)在植物生长发育等多种信号的响应中发挥重要作用。以水稻基因组为模板,通过PCR方法,扩增到一条全长2.2 kb左右的目的片段,序列分析结合RT-PCR表明,该片段由一个完整的开放阅读框组成,无内含子,命名为OsESG1(GenBank登录号:HE 584611),其编码蛋白产物包含749个氨基酸残基。结构分析显示,该蛋白产物包含1个跨膜区、胞外S位点糖蛋白(SLG)、PAN_AP结构域和S_TKc结构域,属于S-结构域型类受体蛋白激酶,推测其在植物生殖发育过程中起作用。     

水稻Xa1基因启动子的克隆及功能分析

Xa1是一个能对日本白叶枯病优势小种(小种1号)产生专化性抗性的R基因,虽已有该基因克隆、表达和功能方面的研究,但对其表达调控分子机制还不很清楚。本研究利用Xa1启动子与GUS报告基因的转基因T1株系,研究了Xa1启动子的时空表达及对不同外源激素的应答特征。结果表明,Xa1启动子驱动的GUS基因在水稻根中的表达量明显高于茎和叶,且在根部的中柱区GUS的表达量明显高于周围组织;在外源MeJA作用下GUS的表达显著增强,在SA和ABA处理下也有一定程度的增强,这些结果暗示Xa1的抗病作用与其在根系中柱的组织特异性表达存在一定的相关性,MeJA对Xa1启动子的活性起重要的调控作用。     

绵羊DRB1基因生物信息学分析

利用生物基因组学数据库,对绵羊MHCⅡ区DRB1基因进行生物信息学分析,以预测DRB1基因编码产物的理化性质、结构与功能,同时构建DRB1同源基因的系统进化树。结果表明,DRB1基因编码产物为不稳定亲水性蛋白,具有明显的信号肽,其切割位点位于29-30位的氨基酸之间。二级结构主要以无规则卷曲和延伸链为主,主要在细胞质中发挥生物学作用。序列分析表明,DRB1编码产物可能具有免疫应答和受体、胁迫应答和信号转导等功能,可能在免疫应答和胁迫应答过程中发挥重要作用,可能对绵羊免疫力和抗病性起关键作用。DRB1基因编码产物氨基酸邻接系统树表明,绵羊DRB1与山羊、羚羊、塔尔羊和牛等物种DRB1氨基酸距离较近,具有高度同源性。     

水稻蛋白激酶基因Pti1的克隆与分析

植物Pti1基因编码丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,是重要的抗病相关基因。在水稻抗褐飞虱基因Qbp1所在的染色体区段存在一个与番茄Pti1基因高度同源的序列片段。从抗虫水稻B5中分离了Pti1基因的全长cDNA克隆,测定了基因组序列。分析发现,水稻中Pti1基因长度有5644bp,含有7个内含子,编码368个氨基酸的激酶蛋白。其蛋白质的C末端在不同植物之间具有高度的保守性,而N末端的变异则相对较大。对不同水稻材料Pti1基因的序列进行了比较,发现药用野生稻与栽培稻之间存在较大的差异,而栽培稻各品种之间的差异较小。讨论了Pti1基因在抗虫防卫反应中可能的作用。     

棉花抗逆相关基因GhDr1的克隆及生物信息学分析

通过TAIL-PCR的方法从棉花中克隆到未知功能的新基因GhDr1,生物信息学分析结果表明,GhDr1的预测蛋白含有酪氨酸激酶和蛋白酶C磷酸化位点、潜在的锌指类功能模块、MAPK磷酸化位点及MAPK相互作用识别位点;与GhDr1同源基因位于同一基因簇的基因多为参与逆境信号转导的蛋白。推测GhDr1基因可能在逆境信号转导途径的磷酸化级联反应中被调节,参与棉花逆境应答的生理过程。     

水稻OsWTF1基因启动子的克隆与表达分析

目的：分析水稻OsWTF1基因启动子的功能及核心序列。方法：利用PCR技术从水稻日本晴基因组中克隆了转录因子WTF1编码区5上游大小为2049bp的调控区域,命名为OsWTF1,将它和长度为1631、608、474、415bp的5端缺失体分别与GUS基因融合构建表达载体,并用农杆菌介导法转化水稻。结果：GUS组织化学分析表明,OsWTF1、Os1631能够驱动GUS基因在根、茎、叶、叶鞘、花药、颖壳上的表达,Os608,Os474,Os415能驱动GUS在根、茎、花药、颖壳中表达,在叶鞘中未表达,而且在叶中的表达也很微弱。结论：OsWTF1启动子核心序列可能位于-1bp--415bp之间,在-608bp--1631bp之间可能存在与基因叶肉特异表达相关的重要元件。     

Endophilin B1 基因及蛋白的生物信息学分析

目的:利用生物信息学方法分析人Endophilin B1基因以及蛋白的结构,为进一步研究其功能和参与的调控机制提供一定的理论依据。方法:通过GenBank搜索Endophilin B1基因及蛋白序列,采用生物信息学方法分析该基因在不同物种中的差异,分析该蛋白的亚细胞定位,二级结构,功能域以及抗原表位。结果:该基因编码一个长度为365个氨基酸的蛋白,具有两个BAR和SH3两个功能域。Endophilin B1蛋白理论分子量为40796.3,理论等电点为5.78。二级结构中α螺旋(H)占56.44%,β折叠(E)占5.48%,无规卷曲占38.08%。Endophilin B1蛋白含有4个可能的N连接糖基化位点,5个潜在的酪蛋白激酶II磷酸化位点,7个豆蔻酰基化位点,3个PKC磷酸化位点以及2个酪氨酸激酶磷酸化位点。并进一步利用DNAstar软件分析了了该蛋白的抗原表位。结论:利用生物信息学预测出的结构和功能信息,能为Endophin B1蛋白的相关研究提供一定的信息基础。