盐生盐杆菌RM07 DNA片段在大肠杆菌中的定点诱变和启动子功能分析

将来源于嗜盐古生菌——盐生盐杆菌(Halobacterium halobium)基因组的RM07 DNA片段以正反两个方向分别插入大肠杆菌启动子探针载体pKK232-8携带的报告基因——氯霉素抗性基因(cat)的上游,得到RM07-cat融合的质粒pRM07-1( )和pRM07-1(-),将其分别转入大肠杆菌HB101,进而检测了不同转化子菌株的氯霉素抗性水平和细胞内氯霉素乙酰转移酶蛋白质浓度。结果表明：正向的RM07片段在真细菌(大肠杆菌)中具有启动子活性,能够驱动cat报告基因的表达;而反向的RM07片段在大肠杆菌中不具有启动子活性。对RM07片段进行了定点诱变分析,检测了特定核苷酸突变对启动子活性的影响,结果进一步精确定位了RM07片段中对在大肠杆菌中的启动子功能有重要作用的关键碱基,并且通过改造RM07片段的碱基组成成分大幅提高了其在大肠杆菌中的启动子活性。     

人和植物中的热激蛋白功能研究新进展

人和植物中的热激蛋白功能研究新进展陈建南张性坦（中国科学院遗传研究所,北京１００１０１）ＮｅｗＰｒｏｇｒｅｓｉｎＲｅｓｅａｒｃｈｏｎＦｕｎｃｔｉｏｎｓｏｆＨｅａｔＳｈｏｃｋＰｒｏｔｅｉｎｉｎＨｕｍａｎａｎｄＰｌａｎｔｓＣｈｅｎＪｉａｎｎａｎＺｈａｎｇ...     

盐生盐杆菌的质粒及其物理图谱

本文用４种不同的方法对１０株盐生盐杆菌是否含有质粒进行了检测,其中６株含有质粒,均属大质粒。几种检测方法中,以ＴＥＮＳ法效果好。Ｊ７菌株含有１种ＣＣＣ结构十分稳定的质粒,称之为ＰＨＨ２０５,其分子量较小,约为１６．７ｋｂ;拷贝数较高,为４９个／每个细胞。该粒在宿主的对数生长后期出现拷贝数高峰。通过限制性酶切分析,确定了５种酶在ＰＨＨ２０５上的切点,其中ＢａｍＨＩ,ＨｉｎｄＩＩＩ和ＸｂａＩ３种酶为单     

盐生盐杆菌DNA 片段RM07的-35、-10区缺失分析

RM07DNA片段分离自嗜盐古菌——盐生盐杆菌R1,该片段不仅在嗜盐古菌内具有启动子功能,而且在大肠杆菌中也具有启动子活性。序列分析表明其上确实含有细菌启动子的-35、-10保守区。进一步通过缺失分析证实该片段就是在大肠杆菌中具启动功能的DNA片段：仅含-10区而缺失-35区的RM07a片段基本上无启动活性;而含-35和-10区的0．1kb片段RM07b具有高于RM07的启动活性。研究结果还表明,RM07片段在大肠杆菌中的启动活性是受环境因素调节的,尤其是对氯化钠浓度的提高具有明显的相关性。因此RM07片段有可能成为构建双功能表达载体的新启动子资源,同时对进一步揭示古菌的融合特征及水平基因转移具有特殊意义。     

盐生盐杆菌DNA片段RM07的-35、-10区缺失分析*

RM0 7DNA片段分离自嗜盐古菌———盐生盐杆菌R1 ,该片段不仅在嗜盐古菌内具有启动子功能 ,而且在大肠杆菌中也具有启动子活性。序列分析表明其上确实含有细菌启动子的 35、 1 0保守区。进一步通过缺失分析证实该片段就是在大肠杆菌中具启动功能的DNA片段 :仅含 1 0区而缺失 35区的RM0 7a片段基本上无启动活性 ;而含 35和 1 0区的0 1kb片段RM0 7b具有高于RM0 7的启动活性。研究结果还表明 ,RM0 7片段在大肠杆菌中的启动活性是受环境因素调节的 ,尤其是对氯化钠浓度的提高具     

具有原核基因启动子活性的蓖麻蚕染色体DNA片段

利用大肠杆菌启动子克隆载体pHE5,研究了蓖麻蚕染色体的Hind Ⅲ酶解片段在大肠杆菌中作为四环素抗性基因启动子的功能作用。蓖麻蚕染色体的Hind Ⅲ片段与pHE5重组,在大约10~6个重组子中获得953株启动子重组体。测定了这些含有重组质粒的菌株抗四环素能力,其中有4株在平板上抗四环素水平超过225微克/毫升。对其中pARP201的插入片段进行了限制性图谱分析和启动子活性区域的缺失定位,证明了pARP-DB(由pARP201衍生而来)中的约0.5kb的外源插入片段具有完整的原核启动子功能。我们分析了这段DNA的部分核苷酸顺序,发现它与原核基因启动子极其相似。     

一个从顶头孢霉中筛选具有启动子功能的DNA片段的简便方法

利用大肠杆菌一酵母穿梭质粒pGBT9构建了一个真菌启动子捕获载体pCBT14,用这个捕获载体构建了含顶头孢霉的0．5～2．0kb片段的染色体DNA文库,并从中筛选到顶头孢霉的24个DNA片段,这些片段能够在啤酒酵母中启动Trp1基因的表达。     

嗜盐古菌启动子DNA片段的功能检测

将来源于嗜盐古菌染色体DNA的启动子片段RM07或RM13插入到启动子探针载体pYLZ_2的报告基因lacZ之前,通过β_半乳糖苷酶酶活性的检测,进一步确证RM07和RM13片段在大肠杆菌(Escherichia coli)中的启动功能。同时用微量热技术检测了大肠杆菌DH5α及其重组菌株在LB培养基中37℃生长过程的热输出功率。T2(pYLZ_2)、TE07(pYL726)、TE07_2(pYL702)、TE131(pYL131)和TE132(pYL132)菌株的生长速率分别比大肠杆菌DH5α降低了6.5%、11%4、1.1%4、7.5%和42.7%。当启动子启动了基因表达时,菌株的生长速率显著降低,热力学参数与酶活性检测结果有较好的一致性。微量热结果表明基因的表达比质粒DNA的复制过程需要消耗更多的能量,对细菌的生理代谢有较大改变。微量热技术为检测基因的表达和转录调控提供了新的方法和思路。     

枯草芽孢杆菌基因启动子的分离与鉴定

利用启动子探针型载体pSUPV4直接在大肠杆菌 (Escherichiacoli)中分离枯草芽孢杆菌 (Bacillussubtilis)WB6 0 0的基因启动子片段 ,获得 5 5个具有卡那霉素抗性的重组子。对 3个抗性最高的重组子pSU -Bs2 ,pSU -Bs4 ,pSU -Bs8进行序列测定和同源性分析发现 ,所克隆到的基因启动子片段均来自于枯草芽孢杆菌的基因组 ,并且具有枯草杆菌基因启动子的保守序列。对抗性最高的Bs2片段进一步研究表明 ,它可以在大肠杆菌中高效地启动来自于短小芽孢杆菌的碱性蛋白酶基因的表达 ,也能在枯草芽孢杆菌中启动卡那霉素抗性基因的表达。     

棒状杆菌中质粒DNA的快速检测方法

在棒状杆菌质粒DNA快速检测中,比较了三种方法:强碱法、快裂法和我们设计的酶法。用强碱法抽提的质粒带很淡,快裂法其次,且不能区别两个分子量相近的质粒;而用酶法则显带清晰,且能很好地区分两个大小相近的质粒,分辨率高,认为在棒状杆菌质粒快速检测中是一种很好的方法。     

A site-specific endonuclease activity in Halobacterium halobium

Abstract In Halobacterium halobium and some related strains, a site-specific endonuclease activity was found. This activity requires 3 M NaCl and 5–10 mM Mg²⁺ ions for function. The 3 cleavage sites in plasmid pBR322 were mapped, but no homology between these sites was found. H. halobium DNA is resistant to cleavage, which may be due to a modification of the DNA. The behaviour of the endonuclease can be explained by the presence of a Type I or Type III-like restriction-modification system.     

盐生盐杆菌在光生物制氢研究中的应用

回顾了近30年来盐生盐杆菌（Halobacterium halobium）在光生物制氢中的应用。就H.halobium可能的光合产氢机理、产氢研究现状及产氢工艺进行概述。分析了盐生盐杆菌光照产氢的主要影响因素,提出未来利用H．halobium生物制氢的研究方向。     

利用大肠杆菌克隆在原核生物中有活性的油菜基因启动子

利用本室构建的基因启动子探针型载体ｐＳＵＰＶ４直接在大肠杆菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ（Ｍｉｇｕｌａ）ＣａｓｔｅｌａｎｉｅｔＣｈａｌｍｅｒｓ）中分离油菜（ＢｒａｓｉｃａｎａｐｕｓＬ．）基因启动子片段,获得卡那霉素抗性重组子３３个。对重组子ｐＲＰ１０做了进一步鉴定：Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交表明ＲＰ１０片段来自油菜基因组,并与基因组中的另一些序列具有同源性;ＲＰ１０片段５′端区域的缺失可使卡那霉素抗性水平从１００ｍｇ／Ｌ降至２５ｍｇ／Ｌ,说明缺失的序列可能影响基因转录效率;序列分析发现ＲＰ１０片段内存在几个真核基因启动子的保守序列;用根癌农杆菌（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ（ＳｍｉｔｈｅｔＴｏｗｎｓｅｎｄ）Ｃｏｎｎ）转化法将ＲＰ１０ＧＵＳ基因转入油菜,组织化学分析显示ＲＰ１０在愈伤组织中可以启动融合的ＧＵＳ基因表达     

启动子优化提高重组大肠杆菌PHA产量

聚羟基脂肪酸酯(PHA)是一类由微生物合成的高分子聚酯的统称,具有生物可降解性、生物可再生性和良好的生物相容性,应用前景广阔。PHA具有类似塑料的材料学性能,倍受到科学界和工业界的关注,但是生产成本较高等原因极大地限制了其大规模应用。本研究通过筛选优化在微氧条件下能够高效调控基因表达的启动子,能有效提高生产菌株在微氧条件下积累PHA的能力,减少生产能耗,降低成本。首先,在大肠杆菌基因表达库中筛选出5个在微氧条件下高效调控基因表达的启动子,与编码红色荧光蛋白的RFP报告基因相连,通过酶标仪检测RFP的荧光信号值,对5个不同的微氧启动子的表达强度进行评估,比较得到其中最高效的启动子Pslp。为进一步提高生产PHA的效率,将2个Pslp序列采用串联的方式构建得到一个新启动子P2slp,利用其调控PHA代谢合成途径中3个关键基因phbC、phbA和phbB的表达。通过发酵扩大生产,在启动子P2slp的调控下,重组大肠杆菌的细胞干重由22 g/L提高至29 g/L,PHA的产量由49.1%提高至81.3%。本研究通过筛选优化启动子提高了重组大肠杆菌生产PHA的产量,为PHA的产业化应用提供了一种有效的提高PHA产量的方法,具有实际价值。     

Characterization of a novel plasmid from extremely halophilic Archaea: nucleotide sequence and function analysis

We determined the complete nucleotide sequence of the 16341 bp plasmid pHH205 of the extremely halophilic archaeon Halobacterium salinarum J7. The plasmid has a G+C content of 61.1%. A number of direct and inverted repeat sequences were found in pHH205, while no insertion sequences were found. Thirty-eight large open reading frames (ORFs) were identified in both strands, and most of them had no significant similarities to known proteins. A putative protein encoded by ORF31 showed 20-41% homology to some hypothetical proteins, which are annotated in several archaeal genome databases as predicted nucleic acid-binding proteins containing PIN domain. Sequence analysis using the GC skew procedure predicted a possible origin of replication. A 4.8 kb PvuII-SnaBI fragment containing both this region and ORF31 was shown to be able to restore replicate of pWL102, a replicon-deficient plasmid in Haloferax volcanii and in H. salinarum R1. Several methods failed to completely cure H. salinarum J7 of pHH205, suggesting that the plasmid probably played an important role in the growth and metabolism of the host. Our work describes a novel haloarchaeal replicon, which may be useful in the construction of cloning and shuttle vectors.