转座子917扦入枯草杆菌SacX基因的双重效应

转座子扦入最普通的效应是基因失活。可是在某些情况下,转座子能在其邻近位置以顺式激活基因的表达。我们前面描述了一种特座子（Ｔｎ９１７）扦入枯草杆菌ＳａｃＸＹ座位。ＳａｃＸ和ＳａｃＹ分别编码包括由蔗糖诱导的外酶（蔗糖６－果糖基转移酶）在内的一个负的和一个正的惆节子。本文的数据表明转座子（Ｔｎ９１７）扦入有两种效应：使ＳａｃＸ失活与提高ＳａｃＹ的转录。后一种效应包含了转座子内的一个或几个成分。     

纳豆激酶基因的克隆及其在枯草杆菌中的表达

为研究纳豆激酶（nattokinase,NK)的生物化学性质,以纳豆芽胞杆菌基因组DNA为模板,PCR扩增包含启动子及3‘端非翻译区的纳豆激酶全长基因序列。经鉴定后构建大肠杆菌－枯草杆菌穿梭表达质粒pBLNK,转化蛋白缺陷型枯草杆菌,筛选表达菌株。表达株培养15h后收集培养上清液,SDS－PAGE分析证实表达产物后,用超滤浓缩、分子筛、离子交换等步骤分离纯化重组NK,每升发酵液得纯度达95％的重组NK约100mg,比活性达12000u/mg。     

枯草杆菌脂肪酶基因在大肠杆菌中的诱导分泌表达

借助生物信息学对已克隆的枯草杆菌脂肪酶LipB2全长基因序列进行比对分析。结果显示该脂肪酶基因全长635bp,编码包括31个氨基酸分泌型信号肽在内的211个氨基酸,与NCBIGenBank中已报道的枯草杆菌属脂肪酶核苷酸序列有94.0%的一致性。将该基因克隆到pET-28a(+)表达载体上,转化大肠杆菌BL21(DE3),利用枯草杆菌脂肪酶的信号肽序列进行了分泌表达。SDS-PAGE电泳显示分泌表达的脂肪酶分子质量约为21kD。对表达条件优化后,在30℃、大肠杆菌菌液OD600值为1.8、乳糖诱导浓度为1.5mM、摇瓶发酵10h后大肠杆菌分泌表达26.0U/mL重组脂肪酶,相比较IPTG的诱导,既实现了脂肪酶的高效表达,又节省了成本。     

多效调控基因degU32(Hy),degQa和degR对枯草芽孢杆菌Ki-2-132生长和蛋白酶发酵的影响

通过向枯草芽孢杆菌Ki-2-132染色体和／或细胞质导入来自枯草杆菌168菌株的degU32（Hy）和degR基因,以及来自芽孢杆菌解淀粉菌株（Bacillus amyloliquefaciens）的degQa基因,对上述基因对枯草芽孢杆菌Ki-2-132细胞的生长、孢子发生、蛋白酶发酵的影响进行了研究。尽管上述多效调控基因来自不同的芽孢杆菌种和菌株,它们在枯草芽孢杆菌Ki-2-132中依然表现多效性。枯草杆菌Ki-2-132degU32（Hy）表现出增高了的蛋白酶产量;当和质粒或染色体上的degQa基因协作,可以进一步依赖葡萄糖的水平和degQa的基因剂量影响细胞生长,增加蛋白酶产量,以及影响孢子的形成。与此不同,degR在degU32（Hy）突变体中并不显著影响其蛋白酶的产量,这一发现支持DegR蛋白通常稳定磷酸化的DegU,而其在degU32（Hy）菌株中不再进一步放大该突变体内已被磷酸化的DegU的调控作用。     

枯草杆菌内切葡聚糖酶基因的克隆及表达

以质粒Ｐｕｃ１８为载体,从枯草杆菌（Ｂａｃｉｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＤＢ１０４基因组中克隆到一个内切葡聚糖酶基因。限制酶切分析表明重组质粒中的插入片段为３.５ｋｂ,其中各含有一个ＥｃｏＲＩ,ＨｉｎｄⅢ和ＰｖｕⅡ位点。该插入片段含有一完整的内切葡聚糖酶基因,其自身启动子能被大肠杆菌转录系统所识别。当加入ｌａｃＺα基因启动子的诱导物ＩＰＴＧ后,内切葡聚糖酶表达量提高２.８倍。加入０.５％葡萄糖能抑制该基因的表达。该基因在大肠杆菌ＤＨ５αＦ′中表达的内切葡聚糖酶分布为：胞外６７.３％,胞间周质３.９％,胞内２８.８％。Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交证实了该插入片段来自供体菌Ｂ．ＳｕｂｔｉｌｉｓＤＢ１０４。     

藏猪繁殖性状多基因效应分析

藏猪是我国特有的高原型地方猪种, 具有适应高海拔恶劣气候环境、抗病、耐粗、肉质鲜美等特点, 但繁殖力低。文章以促卵泡素b亚基(FSHb)、雌激素受体(ESR)、促乳素受体(PRLR)和视黄醛结合蛋白4(RBP4)等基因作为繁殖性状主要候选基因, 测定76头藏猪的基因型, 分析单基因和多基因合并对繁殖性状的影响效应。结果说明, 在藏猪群体中, FSHb、ESR和PRLR基因不同基因型繁殖性状差异显著, 优良基因型分别为BB、BB和AA。藏猪RBP4基因只有2种基因型, 对繁殖性状影响不显著。FSHb-ESR-PRLR基因的合并优良基因型为BB-BB-AA, 多基因聚合效应高于单基因效应。     

甘蓝型油菜含油量的主基因+多基因遗传效应分析

应用多世代联合分析数量性状主基因和多基因混合遗传的统计方法,分析了甘蓝型油菜两个组合的5个世代——亲本P1、P2、F1、F2和F2：3家系材料含油量的遗传效应。结果表明,分离世代F2及F2：3家系含油量次数分布均呈混合的正态分布,符合主基因＋多基因的遗传特征。D-2模型是该项研究两个甘蓝型油菜杂交组合含油量的最适遗传模型,含油量的遗传是由一对加性主基因和加-显性多基因共同控制的。组合1（1141Bx垦C1-1）主基因加性效应值为-1．74,表明亲本1141B中主基因位点上的等位基因降低含油量,而亲本垦C1-1中的等位基因增加含油量。多基因加性效应值和显性效应值分别为1．20和-1．93;F2的主基因遗传力和多基因遗传力分别为68．21％和27．17％;F2：3的主基因遗传力和多基因遗传力分别为81．70％和16．80％。组合2（32Bx垦C1-2）主基因加性效应值为-3．74,表明亲本32B中主基因位点上的等位基因降低含油量,而亲本垦C1-2中的等位基因增加含油量。多基因加性效应值和显性效应值分别为-1．99和0．93;F2的主基因遗传力和多基因遗传力分别为66．20％,和28．10％;F2：3的主基因遗传力和多基因遗传力为81．00％和14．90％。两组合在F2：3家系世代含油量的主基因遗传力均较F2高,因此认为高含油量育种中在F2：3家系进行选择效率较高。     

猪IGF2基因的遗传多态性及其遗传效应分析

采用PCR-SSCP方法检测胰岛素样生长因子2 (insulin-like growth factor 2, IGF2)基因外显子7, 8, 9的多态性, 并分析其对初生重、断奶重、6月龄重和6月龄背膘厚的遗传效应。根据猪IGF2基因的DNA序列(AY044828)设计3对引物, 结果在Ex8引物对扩增的片段上发现了多态性, 并对纯合子进行测序, 发现exon8的53位存在C→T转换, 且检测到3种基因型(AA、AB、BB)。统计结果表明, 3种基因型在各品种中的分布不一致, 长白猪与大白猪比较, 莱芜猪与大薄莲猪比较, 沂蒙黑猪和里岔黑猪比较差异不显著(P > 0.05); 其他猪种间基因型分布的差异均显著(P < 0.01)。固定效应模型分析结果表明, 初生重和6月龄背膘厚基因型间差异显著(P < 0.05), 而断奶重和6月龄重基因型间差异不显著(P > 0.05)。最小二乘分析结果表明, BB基因型个体同AA和AB基因型个体比较初生重的差异显著(P < 0.05), 3种基因型在初生重的大小排列顺序为AB > AA > BB; AA基因型个体同AB和BB基因型个体比较6月龄背膘厚的差异显著(P < 0.05), 3种基因型在6月龄背膘厚的大小排列顺序为BB > AB > AA。因此, 推测IGF2基因对个体的初生重和胴体瘦肉率存在一定的影响, 将IGF2基因应用于猪育种过程中的标记辅助选择可以加快猪的育种进程。     

分泌载体pUS186的构建及地衣杆菌α—淀粉酶基因在枯草杆菌中的表…

利用枯草杆菌的分泌系统构建分泌型表达载体表达和分泌外源基因产物具有重要的商业价值。我们用鸟枪法克枯草杆菌染色体的启动子和信号肽序列。将克隆的序列连接到能在枯草杆菌中复制的质粒ｐＵＢ１８上,获得分泌型表达载体ｐＵＳ１８６。为了测试构建的载体ｐＵＳ１８６的功能,将地衣杆菌α－淀粉酶基因的缺失了启动子和信号肽序列的片段重组进该质粒,经过Ｂａｌ ３１酶切,Ｔ４ ＤＮＡ聚合酶补齐等处理,获得ｐＵＳＡ１８６Ｉ     

同源重组法构建枯草芽孢杆菌224 yugS基因缺失突变株

从枯草芽孢杆菌224的基因组DNA中分别扩增出溶血样基因yugS的上、下游片段,并利用携带新霉素抗性基因(neor)的重组质粒pMD18-T-neo作为骨架,构建了基于yugS基因位点的基因阻断质粒pMD18-T-neo-yugS,线性化后电转化入枯草杆菌224,从新霉素抗性平板上挑取转化子,通过对基因组的PCR鉴定和核苷酸测序证明,确定转化子yugS156为yugS基因缺失突变株。     

猪IGF2基因外显子4b的遗传多态性及其遗传效应

采用PCR-SSCP方法检测猪胰岛素样生长因子2(insulin-like growth factor 2,IGF2)基因外显子4b的多态性,并分析其对初生重、断奶重、6月龄重和背膘厚的遗传效应。根据猪IGF2基因的DNA序列(AY044828)设计引物,在exon4b上发现了一个多态性位点,并对纯合子进行测序,发现13位C→A转换,且存在3种基因型(AA、AB、BB)。统计结果表明,3种基因型在各品种中的分布不一致,长白猪与大白猪比较,莱芜猪与大薄莲猪比较,沂蒙黑猪和里岔黑猪比较差异不显著(P>0.05);其他猪种间基因型分布的差异均显著(P<0.05)。固定效应模型分析结果表明,初生重,断奶重和背膘厚基因型间差异显著(P<0.05),而6月龄重基因型间差异不显著(P>0.05)。最小二乘分析结果表明,BB基因型个体同AA和AB、基因型个体比较初生重和断奶重的差异显著(P<0.05),3种基因型在初生重和断奶重的大小排列顺序为AA>AB>BB;AA基因型个体同AB和BB基因型个体比较背膘厚的差异显著(P<0.05),3种基因型在背膘厚的大小排列顺序为BB>AB>AA。因此,推测IGF2基因对个体的生长速度和胴体瘦肉率存在一定的影响,将IGF2基因应用于猪育种过程中的标记辅助选择可以加快猪的育种进程。     

耐高温α—淀粉酶基因在枯草杆菌染色体上的整合,扩增及表达的研究

通过构建一套整合载体,将来自嗜热脂肪芽孢杆菌的耐高温α－淀粉酶基因以及质粒ｐＣ１９４上的一段Ｃｍ抗性基因随机整合至枯草杆菌１Ａ２８９染色体上,通过提高整合菌的抗氯霉素能力和反复进行整合,可提高耐高温α－淀粉酶基因在染色体上的拷贝数,最终耐高温α－淀粉酶基因在染色体上的拷贝数由整合初的一个增至七个以上。同时,在无选择压力的情况下,可产酶２２０ｕ／ｍｌ以上。     

粉拟青霉类枯草杆菌蛋白酶基因的cDNA克隆及其序列和蛋白质分析

粉拟青霉是一种常见的昆虫病原真菌,被广泛用于生物防治。根据GenBank中已登录的淡紫拟青霉,球孢白僵菌和金龟子绿僵菌的类枯草杆菌蛋白酶基因序列的同源性比较,以它们高度保守的核苷酸序列设计一对引物,采用RT-PCR和3’/5’-RACE相结合的方法,首次从粉拟青霉中克隆出完整的类枯草杆菌蛋白酶cDNA基因。其全序列为2060bp,该序列5’-端和3’-端的非编码序列长度分别为209bp和252bp,开放阅读框为1599bp,编码532个氨基酸,信号肽长度为16个氨基酸。成熟蛋白的氨基酸序列和金龟子绿僵菌小孢变种(CAB63913),玉米赤霉菌(EAA68914),金龟子绿僵菌蚱蜢变种(CAC95047)及柄孢壳(AAC03564)的同源性分别为69%、71%、68%和68%。成熟蛋白具有典型的丝氨酸蛋白酶活性位点,同时有5个半胱氨酸,3个潜在的N-糖基化位点和2个可能的O-糖基化位点。该基因在的密码子第三位碱基的使用上,显示出明显的对C的偏爱。     

在枯草杆菌中有启动子功能的噬菌体T5 DNA片段的克隆

用启动子探针质粒pTG 402为载体,用鸟枪射击法克隆了噬菌体T5 DNA的片段。克隆中的2％含有具启动子功能的插入片段,其中pTG 402-20含有启动功能最强的插入片段。DNA-DNA分子杂交实验结果表明,pTG 402-20的插入片段能与T5 DNA Hind Ⅲ酶切的G和B片段杂交。这个插入片段的大小约为0.84kb。     

MyoG基因的遗传效应分析

实验采用PCR-RFLP技术分析了不同品种猪MyoG基因3′端MspⅠ位点的多态性,应用单标记回归模型分析了不同基因型与相关性状间的关联性及不同等位基因的遗传效应。结果表明：N等位基因能极显著地增加胴体瘦肉率和眼肌面积,降低皮脂含量（P<0.01）,改善胴体产肉量和提高胴体品质;同时,不同基因型对肉质性状的遗传影响作用较大,表现为N等位基因能极显著地降低猪肉品质,使pH值、肉色和肌内脂肪含量降低,并使肌肉的系水力变差（P<0.01）。N等位基因对增加胴体瘦肉率的加性效应值和显性效应值分别为3.929%和-0.602%;对增加眼肌面积的加性效应值和显性效应值分别为2.0985 cm2和-0.5775 cm2;对皮脂率的加性效应值为-3.0245%,显性效应值为-0.4045%。N等位基因对pH1的加性效应值和显性效应值分别为-0.167和0.034;对贮藏损失的加性效应值和显性效应值分别为0.558和-0.347;对肌内脂肪含量的加性效应值和显性效应值分别为-0.963和-0.217。但MyoG基因3′端MspⅠ位点的突变对FOM肉脂仪测定的胴体等级性状的影响不显著（P>0.05）。     

枯草杆菌ylyA基因的绿色荧光蛋白标记

[目的]本研究对枯草杆菌ylyA基因进行荧光标记以便对其产物YlyA在菌体中的位置进行初步观察.[方法]以不同菌株基因组DNA为模板,对ylyA基因进行PCR扩增和序列分析;重新设计引物扩增全长的ylyA并将其克隆到载体pSG1729中,形成gfpmut1-ylyA融合而构建重组载体pNG426;将pNG426转化枯草杆菌168菌株,双交换使gfpmut1-ylyA插入染色体的amyE位点,用碘染色法和菌落PCR对阳性转化子BS363进行鉴定.NA固体培养基上生长的BS363经0.5%木糖诱导表达后,利用表面荧光显微镜技术进行观察.[结果]通过对多个PCR产物的序列分析确定了ylyA基因的正确序列以及正确的翻译起始位点;成功将重组载体pNG426转化枯草杆菌得到了BS363菌株;荧光检测结果表明GFP标记的YlyA分布于菌体的外周,在位置上靠近细胞膜并与之平行排列.[结论]生长缓慢的BS363菌体,在0.5%木糖诱导下产生的荧光标记YlyA蛋白分布在细胞外周,可能在膜生物学中发挥作用.     

猪IGF2基因外显子3的遗传多态性及遗传效应分析

采用PCR-SSCP方法检测猪胰岛素样生长因子2(insulin-like growth factor 2,IGF2)基因外显子3多态性,分析其对初生重、断奶重、6月龄重和背膘厚的遗传效应,根据猪IGF2基因的DNA序列(AY044828)设计引物,结果在其扩增片段上检测到多态性,对纯合子进行测序,发现1GF2-ex3-A36T和IGF2-ex3-G109A两个多态性位点,并且这2个多态性位点完全连锁,检测到3种基因型(A36A/G109G.A36T/G109A和T36T/A109A),统计结果表明,基因型在各品种中分布不一致,长白猪和大白猪与莱芜猪、大薄莲猪、沂蒙黑猪和里岔黑猪比较基因型分布差异极显著(P＜0.01);其它猪种间基因型分布差异均不显著(P＞0.05),固定效应模型分析结果表明,初生重和背膘厚基因型间差异显著(P＜0.05),而断奶重和6月龄重基因型间差异不显著(P＞0.05),最小二乘分析结果表明,A36A/G109G基因型个体同A36T/G109A和T36T/A109A基因型个体比较初生重和背膘厚的差异显著(P＜0.05),3种基因型初生重的大小排列顺序为A36A/G109G＜A36T/G109A＜T36T/A109A,背膘厚的大小排列顺序为A36A/G109G＞A36T/G109A＞T36T/A109A.因此,推测IGF2基因对个体的初生重和胴体瘦肉率存在一定的影响,将IGF2基因应用于猪育种过程中的标记辅助选择,将可以改善猪肉品质,加快猪的育种进程.     

利用杂种F_2世代鉴定数量性状主基因-多基因混合遗传模型并估计其遗传效应

大量实验数据和OTL作图结果表明:控制数量性状的基因中既有遗传效应较大的主基因,又有遗传效应较小的多基因,其分离世代表现出多峰性,即出现多个分布混合的特征。本文利用混合模型理论的AIC信息准则在F_2世代中鉴定影响数量性状的主基因的存在,当主基因存在时通过分离分析估计主基因的遗传效应以及主基因的遗传变异占总变异的分量;同时还提出利用P_1、P_2、F_2和F_2 4个世代鉴定多基因存在的方法。以大豆开花期性状为例说明了该方法的应用,在所分析的骨绿豆×上海红芒早杂交组合的F_2世代数据中发现有主基因的存在,主基因表现出完全显性(晚开花),并且有多基因存在。     

油菜半矮秆新种质10D130株高主基因+多基因遗传模型分析

株高是油菜重要的株型改良性状之一。油菜株高对提高油菜的产量、抗倒伏能力和机械收获都有非常重要的作用。本文利用株高性状差异较大的半矮杆新种质10D130和常规品种中双11进行杂交,构建6世代遗传分析群体（P1、F1、P2、B1、B2、F2）,以主基因＋多基因混合遗传模型对该组合株高进行遗传分析。结果表明：10D130?中双11号组合株高受到1对加性-显性-上位性主基因 加性-显性-上位性多基因控制（D模型）。其中,株高性状加性效应值为-8.58,显性效应值为7.44.在B1、B2和F2 3个分离世代群体中主基因遗传率分别为23.52％、0.91%和17.81%,多基因遗传率分别为30.05％、68.05%和39.35%。10D130半矮杆遗传分析揭示在该材料的运用上不仅要考虑主基因的作用、还要考虑多基因与环境对株高性状的影响。