蛇毒锯鳞蝰素基因Leul4－Lys15－Glu16的定点突变

本研究的目的是利用蛋白质工程定点突变的方法,在蛇毒锯鳞蝰素基因分子上增加另一个保守序列ＲＧＤ（１４位精氨酸残基,１５位甘氨酸残基,１６位天冬氨酸残基）,以其增加该分子的生物活性,并探讨蛋白质一级结构,空间结构和功能的关系。在质粒ｐＪＣ２６４的基础上,利用ＰＣＲ定点突变方法,对蛇毒锯鳞蝰素基因Ｌｅｕ１４－Ｌｙｓ１５－Ｇｌｕ１６进行定点突变,使相应的ＤＮＡ片段变成表达Ａｒｇ１４－Ｇｌｙ１５－Ａｓｐ１６的核苷酸顺序,经酶切和ＤＮＡ测序鉴定正确。ＣＮＢｒ裂解后,用反相ＨＰＬＣ分析,分离制备突变体蛇毒锯鳞蝰素,制备的突变体蛇毒锯鳞蝰素的Ｎ－末端１０个氨基酸残基与天然蛇毒锯鳞蝰素的相同。在人的富含血小板血浆测活体系中,经１０μｍｏｌ／Ｌ的ＡＤＰ诱导,突变体蛇毒锯鳞蝰素的ＩＣ５０为３．０×１０~（－７）ｍｏｌ／Ｌ;重组野生型蛇毒锯鳞蝰素的ＩＣ５０为４．０×１０~（－７）ｍｏｌ／Ｌ;天然蛇毒锯鳞蝰素的ＩＣ_（５０）为２．８×１０~（－７）ｍｏｌ／Ｌ。此外,就蛇毒锯鳞蝰素中保守序列Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ａｓｐ以及其空间构象对蛇毒锯鳞蝰素抑制血小板凝集之间的关系进行了讨论。     

蛇毒锯鳞蝰素融合蛋白的发酵与纯化

研究大肠杆菌表达重组蛇毒锯鳞蝰素(Echistatin,Ecs)融合蛋白的发酵和纯化工艺。将Ecs基因插入表达载体pTXB1,转化E.coliBL21(DE3)构建工程菌。对工程菌进行补料分批培养并诱导表达,研究培养基、培养和诱导时间对工程菌生长和目的蛋白表达的影响,几丁质亲和层析纯化Ecs融合蛋白,经DTT裂解后,检测Ecs活性。发酵后菌体湿重可达75g/L,融合蛋白表达量约占总蛋白的35%,重组质粒在BL21宿主菌中传代稳定。亲和层析纯化后,得到Ecs单体,得率为28mg/L发酵液。生物学活性分析显示,重组Ecs能有效抑制血小板的聚集,其活性与天然Ecs相似。优化了Ecs融合基因工程菌的发酵和纯化条件,为规模化生产奠定基础。     

基因重组Echistatin发酵工艺的优化

目的:利用基因工程方法对一种蛇毒锯鳞蝰素蛋白的发酵纯化工艺进行优化,以提高目的蛋白的产量和纯度。方法:对工程菌进行发酵培养并诱导表达,研究不同的培养基、不同补料方式、溶解氧浓度、培养和诱导时间对工程菌产量和目的蛋白表达量的影响,利用几丁质亲和层析纯化Ecs融合蛋白,通过合适温度和pH裂解融合蛋白得到Ecs纯品,并鉴定和检测Ecs活性。结果:经过高密度发酵优化后,菌体湿重可达110g/L,目的蛋白表达量约占总蛋白的40%;亲和层析纯化后,得到Ecs单体,得率为68mg/L发酵液。生物学活性分析显示,重组Ecs能有效抑制血小板的聚集,其活性与天然Ecs相似。结论:通过发酵和纯化工艺优化,大大提高了目的蛋白产量,为进一步规模化研究和生产奠定了基础。     

一种简单、快速、高效的基因定点突变方法

小规模抽提含有编码小鼠补体Ⅱ型受体(mCR2)cDNA的质粒,体外合成两对寡核苷酸突变引物,利用PCR反应将突变引入mCR2 cDNA中,即产生P15S和T68Y两种定点突变。然后用DpnI消化PCR产物以去除模板DNA,取适量消化产物转化大肠杆菌XL1-Blue,随机挑选克隆进行测序筛选、鉴定所需突变株。结果表明这一新方法不仅操作简单、快速,而且突变率极高,几乎100％。     

青霉素G酰化酶基因Ser177的定点突变

本研究用缺口以链法对肠杆菌青霉素Ｇ酰化酶（ＰＧＡ）基因Ｓｅｒ１７７进行寡核苷酸定点突变。通过ＮＩＰＡＢ（２－硝基－５－苯乙酰胺苯甲酸）试纸法筛选和测序鉴定,获得突变体Ｃｙｓ１７７,Ｇｌｙ１７７,Ａｒｇ１７７和Ａｓｎ１７７。它们的ＰＧＡ活性均已丧失。酶蛋白电泳分析表明突变体蛋白在体内正常表达。推测ＰＧＡ Ｓｅｒ１７７秀可能位于酶底物结合中心,是酶活性所必需,不能被置换。     

大肠杆菌glgC基因的定点突变及功能分析

摘要: 利用PCR从Escherichia coli JM109基因组中扩增到全长为1 296 bp的glgC基因编码区, 通过PCR重组方法进行点突变, 获得氨基酸突变的3个突变体, 分别是Pro295Ser(Val121Ala, Met151Ile和Val334Asp)、Gly336 Asp单点突变和Pro295Ser/Gly336Asp(Lys109Arg), 其基因分别命名为295⁺³、336和295/ 336⁺¹。将突变和未突变的基因分别克隆到pET32-a, 构建重组质粒pET-glgC、pET-295⁺³、pET-336和pET-295/ 336+1, 在文中分别简称为a、b、c和d。转化大肠杆菌BL21(DE3), 在1 mmol/L IPTG 诱导下表达。SDS- PAGE 电泳分析显示, 在约67 kDa 处有1条明显与预期大小一致的蛋白质, 表明目的基因已得到融合表达。上述转化子的碘染和糖原含量测定结果, 第336位的Gly变成Asp后, 宿主菌的糖原含量提高; Pro295Ser/Gly336Asp(Lys109Arg)的突变导致宿主菌的糖原含量与Gly336Asp突变体相近, 表明在336突变基因的基础上增加Pro295Ser的突变没有进一步加大宿主菌中AGPase酶的反馈抑制效应的降低。已有的结果显示, Pro295Ser可以降低AGPase酶的反馈抑制效应活性, 而实验中295⁺³突变基因转入宿主菌后细胞糖原含量明显降低, 推测这个结果可能是295⁺³中的Val334Asp的突变造成, 而334位的氨基酸可能是AGPase功能域中的一个重要位点。     

“三黄”鸡采精量和受精率的方差组分估计

用4种方法(Henderson方法Ⅰ、 MIVQUE、ML、REML)估计了两个“三黄”慢羽系的公鸡采精量和种蛋受精率的方差组分,并计算了它们与产蛋性状间的遗传相关。结果表明,采精量为中等到高遗传力性状(h2=0.29-0.3 9);受精率的遗传方差在品系之间存在着较大的差异,L系受精率性状的遗传力低,而Ⅰ系受精率为中等到高遗传力性状。采精量和受精率与开产日龄、 43周龄蛋重以及64周龄产蛋量间遗传相关不显著。此外,还对4种方差组分估计方法和两种数值转换方法的实际效果作了比较。     

人胰岛素原基因B10位定点突变对增强胰外表达效率的实验研究

目的构建在肝细胞内增强表达成熟人胰岛素的生理调控性人胰岛素原基因重组质粒。方法利用PCR定点突变技术在B-C及C-A连接处已两点突变的人胰岛素原基因上进行B10位突变,并在其上游连接肝细胞特异的3倍体葡萄糖反映元件(GLRE3)和胰岛素样生长因子结合蛋白-1启动子(IGFBP-1P)。经酶切后将含有调控元件的3点突变人胰岛素原基因(GLRE3-IGFBP-1P-3mINS)插入逆转录病毒载体(pLXSN),脂质体介导转染大鼠肝癌细胞CBRH7919后检测成熟胰岛素表达情况及与含有调控元件的2点突变人胰岛素原基因(GLRE3-IGFBP-1P-3mINS)表达体的表达差异。结果人胰岛素原基因的B10位组氨酸编码序列CAC突变为门冬氨酸编码序列GAC。构建了含调控元件的B10位门冬氨酸人胰岛素原基因逆转录病毒载体质粒(pLXSN-GLRE3-IGFBP-1P-3mINS),酶切、PCR及测序鉴定各段基因碱基序列及连接方向正确。pLXSN-GLRE3-IGFBP-1P-3mINS经脂质体包裹转染大鼠肝癌细胞,细胞外液含5.0、25.0mmol/L的葡萄糖浓度下胰岛素含量分别为5.03±0.72、43.90±2.30mU/L。未进行B10位突变的重组体转染组在同样葡萄糖浓度下胰岛素含量分别为<2.00、2.10±0.23mU/L。结论成功构建了含调控元件的B10位门冬氨酸人胰岛素原基因逆转录病毒载体重组质粒,该重组体已整合入鼠肝癌细胞基因组,其表达效率显著提高并受葡萄糖生理性调控。     

一种快速构建集胞藻6803petBD必需基因定点突变株的方法

{{@ convertAbstractHtml(article.abstractinfoCn, "cn")}}       

猪瘟病毒E2基因的定点突变、在大肠杆菌中的高效表达及表达产物的免疫原性

用重组PCR技术对猪瘟病毒石门株E2基因进行了定点突变, 然后将突变后的基因克隆至表达载体质粒pET-28a(+)中,构建成重组质粒pETE2。将pETE2转入受体菌BL21(DE3)plysS中,在IPTG的诱导下, 重组转化菌可高效表达目的基因, 表达量平均可达菌体蛋白总量的28%。免疫印迹和间接ELISA表明所表达的蛋白是CSFV特异性的。此重组蛋白免疫的家兔可抵抗猪瘟兔化弱毒的攻击。     

猪肌肉生长抑制素基因5‘调控区T→A突变与生长性状的关系分析

生长速度是猪育种中选择的主要目标性状之一,鉴定影响生长速度的QTL或基因具有重要的实践意义和理论价值。对猪肌肉生长抑制素基因（myostatin,MSTN)5‘调控区T→A突变与生长性状的关系进行了分析。突变所产生的基因型的判定采用PCR－RFLP方法进行。猪生长性状的测定指标包括60日龄体重（body weight at 60d,BW60)、前期平均日增重（average daily gain of stage one,ADG1)、后期平均日增重（average daily gain of stage two,ADG2)和全期平均日增重（average daily gain of whole stage,ADG),所采用的记录数分别来自165．276,275和275头无亲缘关系个体。采用SAS软件包的GLM程序对MSTN基因型与猪生长性状的关系进行分析。结果表明,MSTN基因型对猪BW60（P＝0．0522）,突变等位基因的携带者（基因型为TA）具有较高的后期平均日增重。     

猪肌肉生长抑制素基因5′调控区T→A突变与生长性状的关系分析

生长速度是猪育种中选择的主要目标性状之一,鉴定影响生长速度的QTL或基因具有重要的实践意义和理论价值.对猪肌肉生长抑制素基因(myostatin,MSTN)5′调控区TA突变与生长性状的关系进行了分析.突变所产生的基因型的判定采用PCR-RFLP方法进行.猪生长性状的测定指标包括60日龄体重(body weight at 60d,BW60)、前期平均日增重(average daily gain of stage one,ADG1)、后期平均日增重(average daily gain of stage two,ADG2)和全期平均日增重(average daily gain of whole stage,ADG),所采用的记录数分别来自165,276,275和275头无亲缘关系个体.采用SAS软件包的GLM程序对MSTN基因型与猪生长性状的关系进行分析.结果表明,MSTN基因型对猪BW60,ADG1和ADG2的效应不显著(P＞0.1),对ADG2的效应在剔除基因型与品种的互作效应以后几乎达到显著水平(P＝0.0522),突变等位基因的携带者(基因型为TA)具有较高的后期平均日增重.     

透明质酸生产菌溶血素S基因缺失突变菌株的构建及其特性北大核心CSCD

【目的】马链球菌兽疫亚种是工业上生产透明质酸的主要菌种,该菌能产生引起宿主细胞溶血的链球菌溶血素S(streptolysin S,SLS)毒素,因而其产品的安全性一直是人们所担心的问题。本实验的目的就是通过基因敲除的方法构建不产SLS的透明质酸生产工程菌,同时探讨溶血素sag A基因缺失对菌株透明质酸合成和其他毒力因子的影响。【方法】利用温度敏感/自杀性质粒p JR700载体系统,构建马链球菌兽疫亚种sag A基因缺失突变株;通过PCR扩增,溶血平板和SLS含量测定等方法确定sag A基因缺失;采用分光光度、SDS-PAGE和细胞毒性试验等分析方法,对野生菌株和sag A基因缺失突变菌株透明质酸含量、透明质酸分子量、溶血素Hylc、透明质酸分解酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶和菌体表面蛋白等相关毒力因子进行对比研究。【结果】获得了透明质酸产量提高30%而溶血活性极低的马链球菌兽疫亚种sag A基因缺失突变株。该突变株与野生菌株相比较,透明质酸分解酶活性增加而透明质酸相对分子量降低,此外,与毒力相关的表面蛋白含量、溶血素Hylc和甘油醛-3-磷酸脱氢酶活性也显著降低。细胞毒性实验结果表明,野生菌株与sag A基因缺失突变菌株的培养物上清液,对细胞活性的影响存在显著差异。【结论】在马链球菌兽疫亚种中sag A不仅是表达溶血素SLS的基因,同时sag A基因对菌株透明质酸合成、透明质酸分解酶、菌体表面蛋白、溶血素Hylc和甘油醛-3-磷酸脱氢酶等都具有调节作用。