在基因组的"深海"中钓鱼(FISHing)

应用荧光素进行原位杂交的技术（ＦＩＳＨ）已为当今遗传学家广泛应用,其名是英文“Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｉｎｓｉｔｕｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ”的简称,恰好是英文的“鱼”字。按照此技术本身的含义,更形象的表达应是“ＦＩＳＨｉｎｇ”——钓鱼,即可以用它在...     

用万能引物PCR法从YAC中分离制备荧光原位杂交探针的研究

报道了一种从微量且未知碱基顺序的YAC DNA中制备FISH探针的新方法——万能引物PCR(UP PCR),即把复性后的UP-Linker连接于PFGE分离后经Alu Ⅰ酶切的YAC DNA上,再用UP对其进行PCR扩增和标记。由于Alu Ⅰ的广谱性和UP与Linker长度不同等,使该法能根据PCR效率调节扩增产物的广泛性向特异性的转变,且产物能覆盖YAC嵌入DNA的全长。此法制备的人21号染色体FISH探针,特异性强,杂交信号明亮,21号染色体的检出率高。该法稳定简便。     

PCR快速筛选重组克隆方法的建立

目的：建立一种PCR技术快速筛选重组克隆的方法。方法：用Triton裂解菌落作为模板,以pMD-18T载体多克隆位点设计的引物与目的基因猪β-INF引物设计不同组合,PCR扩增待检重组克隆。结果：PCR技术快速筛选出猪β-INF重组克隆并鉴定了插入方向。结论：在采用PCR方法直接使用细菌菌落参与反应可以快速筛选重组克隆。     

PCR筛选BAC文库和直接BAC末端测序方法的建立

建立了一种用PCR方法筛选富含高度重复序列的大麦BAC DNA 文库和直接对 BAC DNA进行末端测序的方法.用PCR技术进行大麦BAC DNA 文库(含816个平板,每个平板含384个克隆)的筛选分4步进行.在实验中,建立了两个水平的BAC DNA池(一级池和二级池).一个二级池由一个平板(含有384个克隆)的DNA 组成,一个一级池由连续10个稀释100倍的二级池的DNA混合而成(如1～10,11～20等),共82个一级池.BAC DNA 文库筛选的第一步是对82个一级池的筛选.得到阳性一级池后(如2号一级池),对其所含的10个二级池(从11～20)进行第二步筛选.得到阳性二级池后,培养相应的阳性平板的所有克隆(384个),从头开始(左上侧),每相邻的4个克隆为一组,在96孔板上(4 X 96=384) 进行第三轮PCR反应;之后对筛选结果为阳性的4个克隆分别进行菌落 PCR(第四轮)得到单一阳性克隆.根据BAC DNA Hind III 酶切指纹图谱,对同一引物筛选的BACs进行重叠群作图(Contig).对代表contig 的两端的BAC DNA直接进行末端测序并对测序结果Blast,以检测其在大麦中是否属于单拷贝序列.根据测序和Blast结果设计引物,用中国春附加系(附加大麦染色体)对来自BAC克隆的引物进行染色体定位并用分离群体进行遗传学作图,以确定是否可以用作下一步的染色体步行.     

猴免疫缺陷病毒（SIV）实时荧光定量PCR检测方法的建立

目的建立快速、敏感、特异的猴免疫缺陷病毒（SIV）TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法,对SIV病毒核酸进行定量检测。方法RT—PCR扩增SIVmac251保守gag基因序列796bp片段,进行TA克隆,构建标准品质粒pMD—SIVgag。通过对SIV定量外标准品的定量分析,优化反应体系,检测TaqMan探针实时荧光定量PCR方法的灵敏度、特异性和重复性。结果所建立的SIVQPCR检测方法,质粒DNA模板在10’～10。拷贝之间表现较好线性和相关性,标准曲线所得斜率为-3．26,相关系数为0．999。检测灵敏度达到200拷贝,方法重复性测试,检测25份临床样品CV％均小于1％。结论建立的SIVQPCR检测方法特异性、敏感性高,稳定性好,可用于定量测定猴免疫缺陷病毒（SIV）核酸拷贝量。     

噬菌体抗体库的构建及抗乳腺癌细胞单链抗体的筛选

构建抗人乳腺癌细胞MCF 7的噬菌体单链抗体库 ,从中筛选MCF 7细胞特异性单链抗体。用MCF-7细胞免疫BALB C小鼠 ,取脾脏 ,提取总RNA ,用RT-PCR技术扩增小鼠抗体重链 (V_H)和轻链 (V_L)可变区基因 ,经重叠PCR(SOE-PCR) ,在体外将V_H和V_{L连接成单链抗体 (scFv)基因 ,并克隆到噬菌粒载体pCANTAB5E中 ,电转化至大肠杆菌TG1,经辅助噬菌体超感染 ,构建噬菌体单链抗体库。从该抗体库中筛选特异性识别MCF-7细胞的噬菌体单链抗体 ,将表面展示单链抗体的单克隆噬菌体转化大肠杆菌TOP10进行可溶性表达。成功地构建了库容为12×10⁶ 的抗MCF-7乳腺癌细胞的单链抗体库 ,初步筛选到了与MCF 7细胞特异性结合的scFv,Westernblot检测表明 ,在大肠杆菌TOP10中实现了单链抗体可溶性表达}     

用于库-库筛选体系的抗原表达载体的构建

选择感染性噬菌体(SIP)技术是研究蛋白质相互作用的良好手段,体内SIP技术在理论上适于库-库筛选,而双载体共包装聚合噬菌体方式是一条有效途径.为构建适合库-库筛选的抗原表达载体,选用TG10载体作为基本载体进行改造,首先克隆噬菌体M13基因间隔区的序列插入TG10中得到质粒pTMI,克隆基因Ⅲ的N1N2区序列,并在其3′端加上一段G4T柔性多肽,将NIN2插入到pTMI载体中Lac启动子的下游得到pTMIN,化学合成Ptrc启动子序列替换pTMIN中的Lac启动子及部分功能基因序列,构建成抗原表达载体pTTMIN,化学合成c-myc的十肽表位插入到G4S后进行融合表达,采用ELISA和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测抗原的表达,结果显示抗原得到了融合表达.用抗体呈现载体对pTTMIN性能进行鉴定,结果表明抗原表达载体可以与抗体呈现载体高效的共包装.综合以上结果说明抗原表达载体构建成功,可望用于库-库筛选体系.     

向日葵rRNA基因克隆及其染色体定位研究

该研究以内葵杂3号三交种为材料,采用同源序列法克隆了5SrRNA和18SrRNA基因并进行了序列测定,测得片段长度分别为515bp和1808bp。以5SrRNA、18SrRNA和45SrRNA基因为探针,分别与内葵杂3号三交种染色体进行荧光原位杂交（FISH）分析。结果表明：45SrRNA和18SrRNA基因均得到3对杂交信号且位点分布相同,分别位于第3对和第10对染色体及第2对随体染色体的短臂末端;5SrRNA基因的信号位点共有2对,分布在第7对和第10对染色体短臂端部。     

用三色荧光原位杂交(Three-Color FISH)检测小鼠精子中染色体数目异常的研究

用小鼠X、Y和8号染色体特异的DNA探针,与经DTT（dithiotreitol）和LIS（lithium-3,5-diiodosalicylicacid）解聚的小鼠附单精子进行三色荧光原位杂交（fluoresceoceinsituhybridization,FISH）,以检测精子中的染色体数目异常,并与MMⅡ染色体分析比较．结果表明精子三色FISH具有以下优点和特点：（1）方法敏感稳定,且简便快速;（2）在每一个体至少分析10000尾精子的基础上计算非整倍体单,因此结果更为准确;（3）能检测多倍体即减数分裂停止的发生率及停止的时期;（4）不仅能测定发生于试数分裂Ⅰ（MI）的染色体分离异常,还能检测发生于减数分裂Ⅱ（MII）的不分离和丢失．并对探针的选用、分析标准的建立以及三色FISH用于精于染色体分析的必要性等进行了讨论．     

添加有扩增内标的沙门氏菌荧光定量PCR 检测体系的建立与评价

【目的】建立添加有扩增内标(IAC,Internal amplification control)的沙门氏菌EvaGreen荧光定量PCR检测体系,提高PCR检测可靠性。【方法】通过比较已有沙门氏菌属细菌的基因组序列,筛选沙门氏菌属特异检测靶点,设计特异引物;再用复合引物法构建扩增内标,优化参数,建立沙门氏菌内标PCR检测体系,利用特异性和灵敏度实验评价体系的检测性能。【结果】筛选得到的新特异靶点基因编码III型分泌系统蛋白(ssaQ)。针对该基因设计特异引物(SsaQ6),建立了添加有扩增内标的常规PCR和EvaGreen荧光定量PCR检测体系;二者对151株沙门氏菌和34株非沙门氏菌的检测符合率均达100%,对基因组DNA的检测下限达14.9拷贝/PCR和2.76拷贝/PCR;人工污染牛奶样品(初始染菌量:4-6 cfu/10 mL),増菌10 h和8 h后分别可检出沙门氏菌。【结论】本研究发掘的新靶点基因ssaQ特异性强,基于这一新靶点建立的添加有扩增内标的EvaGreen荧光定量PCR比常规内标PCR的检测限更低,重复性更好,快速方便,在12 h内即可得出检测结果,并且定量准确,有利于推进沙门氏菌PCR检测方法的标准化应用。     

Rapid and reliable screening of a tomato YAC library exclusively based on PCR

An improved procedure is presented to select clones from a tomato yeast artificial chromosome (YAC) library. The procedure is based exlcusively on the polymerase chain reaction (PCR). We combined DNA from approximately 36,000 YAC clones in pools containing 96-single YAC clones from one master plate and further in super pools representing 10 master plates. This pooling strategy allows the selection of single YAC clones homologous to a target sequence after three rounds of PCR using super pools, single pools, and single YAC clones as a template. Single YAC clones were spheroplasted prior to the third PCR round in order to omit the conventional radioactive colony hybridization step. To date, we applied this PCR-based selection strategy to isolate clones homologousto ten different sequence-tagged sites (STS) that are linked to genes targeted for map-based cloning. The selection of YAC clones can be readily accomplished within three days. The PCR-based screening strategy is easy to set up and contributes to a further acceleration of the construction of YAC contigs.     

快速简便筛选cDNA文库的SSS法

建立了一种快速简便筛选cDNA文库的方法—SSS法（subsection screening）。该方法用cDNA噬菌体平板划块分组和根据目的基因设计的一对特异性引物,用PCR技术逐级筛选cDNA文库获得目的基因。与其它筛选cDNA文库的方法相比,该方法范围可控,目标明确,易于获得目的基因,而且快速、简捷、省时,一般可在一周内筛选出目的基因。本实验室利用该方法在半个月内筛选出了一个查耳酮异构酶(chalcone isomerase)(CHI)基因,一个黄酮类化合物3′-羟化酶(flavonoid 3′hydroxylase)(F3′H)基因,一个热激蛋白(heat shock protein)(HSP)基因和一个1 484 bp 热激蛋白基因片段。此方法用于同时筛选多个基因,可收到事半功倍的效果,对其它文库筛选也有借鉴意义。 Abstract:A quick and simple method subsection screening (SSS) method for screening cDNA library by PCR was established.With this method,cDNA phage plate was cut into several blocks and a couple of primers was designed according to target gene.And then the target genes were obtained by screening cDNA library.Comparing with other methods,this method has many advantages such as controlled range and clear target,and also quick and simple for obtaining the target genes.It is possible to get a target gene in one week in general by this method.Thus,the CHI gene,F3′H gene,HSP gene and one HSP partial fragment,were obtained respectively in half month in our lab.We can get twice the result with half the effort when we screen several genes in the same time.It is also suitable to screen other libraries.     

人基因组YAC分子克隆库的构建及DMD基因YAC克隆的筛选

以pYAC4为载体,以正常人白细胞和含4条X染色体的细胞株GM1414为DNA源构建成人基因组YAC(Yeast Artificial Chromosome,酵母人工染色体)分子克隆库,已得到原始克隆近2万个,插入DNA片段长度在400—1000kb,从其中选出一组YAC克隆,它们含有DMD基因全部DNA顺序。     

人基因组YAC克隆DNA的Alu－PCR反应条件的系统研究

在人基因组ＹＡＣ克隆的Ａｌｕ－ＰＣＲ指纹分析中要求ＤＮＡ且扩增带具有ＹＡＣ特征性;在用ＡｌＵ－ＰＣＲ方法对ＹＡＣ克隆中的人类基因组ＤＮＡ片段进行特异的同位素标记时则要求被扩增标记的ＤＮＡ序列在插入片段中具有一定的弥散性。我们建立了两种不同的Ａｌｕ－ＰＣＲ反应体系以满足这一不同要求,并已得到较为满意的结果。根据不同条件下的Ａｌｕ－ＰＣＲ结果,分析了多引发位点ＰＣＲ中的一些现象,并作出了解释。     

Construction of a bovine yeast artificial chromosome (YAC) library

We have constructed a bovine yeast artificial chromosome (YAC) library to provide a common resource for bovine genome research. We used leukocytes of a Japanese black bull ( Bos taurus ) as the DNA source, AB1380 for the yeast host, and pYAC4 for the vector. The library consists of 24 576 clones arranged in 256 96-well microtiter plates. An average insert size estimated from the analysis of 251 randomly selected clones was 480 kb. The rate of chimeric YACs evaluated by fluorescence in situ hybridization (FISH) analysis of 44 randomly selected clones was 36·4%. To estimate the number of genome equivalents, PCR-based screening was performed with 48 primer pairs and isolated 3·2 clones on average. In order to provide broad access for the scientific community, this library has been incorporated into the Reference Library system which provides high density filters for colony hybridization screening and a common database of the library.     

微量RNA的cDNA PCR文库的构建

使用PCR（polymerase chain reaction)技术,调制了mRNA的cDNA PCR文库,实验证明,cDNA PCR文库能使原cDNA的量放大数百倍,同时,使用人体K562培养细胞的总RNA,对cDNA PCR文库法和反转录中的β-Actin的cDNA量进行了比较,cDNA PCR文库法中的β-Actin的cDNA量大于高于反转录中的β-Actin的cDNA量,使用75pg的人体K562培养细胞的总RNA,调制成50ul的CDNA PCR文库,使用1ul的CDNA PCR文库进行了PCR反应时,可对文库中β-Actin的CDNA进行PCR检测,因此,CDNA PCR文库显示了良好的信息放大性能。     

Rapid Screening of a Novel Arrayed Medaka (Oryzias latipes) Cosmid Library

Medaka (Oryzias latipes) has many advantages for genetic and developmental studies. With recent advances in the genome analyses of other species, rapid accumulation of resources for medaka genomics is expected. In this study, we generated an arrayed medaka cosmid library from the HNI inbred strain, carrying a 40-kb insert on average. The library consists of approximately 120,000 clones with a 6-fold genomic coverage. Cosmid clones can be screened within 2 days using standard polymerase chain reaction. Considering the advantage of the cosmid insert size and the compact genome size of the medaka, this library provides a powerful tool for future genome analyses.