一株H5N1亚型禽流感病毒的分离与鉴定

2004年1月湖北宜昌某鸡场暴发疫病,从该鸡场濒死鸡肺组织中分离到了一株病毒,电镜切片观察到典型的禽流感病毒粒子;采用ELISA检测禽流感抗原为阳性;RT-PCR扩增HA、NA基因并测序,经BLAST分析,HA基因与A／Goose／Guangdong／1／96(H5N1)HA基因同源性为97％;NA基因与A／Goose／Guangdong／1／96(H5N1)NA基因同源性为96％,确定该分离株为禽流感病毒H5N1亚型(A／Chicken／Yichang／Lung-1／04(H5N1))。     

一株H5N1亚型禽流感病毒的分离与鉴定

2004年1月湖北宜昌某鸡场暴发疫病,从该鸡场濒死鸡肺组织中分离到了一株病毒,电镜切片观察到典型的禽流感病毒粒子;采用ELISA检测禽流感抗原为阳性;RT-PCR扩增HA、NA基因并测序,经BLAST分析,HA基因与A/Goose/Guangdong/1/96(H5N1)HA基因同源性为97%;NA基因与A/Goose/Guangdong/1/96(H5N1)NA基因同源性为96%,确定该分离株为禽流感病毒H5N1亚型(A/Chicken/Yichang/Lung-1/04(H5N1)).     

禽流感H5N1亚型病毒对五个不同品系小鼠致病性的比较(英文)

目的比较了不同遗传背景小鼠对禽流感H5N1亚型病毒的致病敏感性,为H5N1禽流感模型制作和机理研究提供依据。方法近交系BALB/c、C57BL/6和封闭群ICR、NIHSwiss和KMSwiss共五个不同品系小鼠。每个品系实验动物30只,分接毒组20只,空白对照组10只,每组雌雄各半。病毒株为A/Goose/Guangdong/NH/2003(H5N1),经测定TCID50为10-4.875/mL。接毒组通过鼻腔接种0.1mL病毒液,对照组接种正常鸡胚尿囊液。小鼠接毒后连续观察14d,观察记录临床症状、体温、体重变化,对在实验期间死亡和实验14d结束后仍然存活的小鼠均进行组织器官病理取材,进行RT-PCR病毒分离检测、HE染色及H5N1抗原特异性免疫组化染色。结果①临床症状:H5N1禽流感病毒能感染五个品系的小鼠,引起呼吸急促等症状和一过性体重、体温下降。②死亡情况:小鼠在接毒后第1天即出现死亡,死亡的高峰期集中在接毒后第3～6天。五个品系小鼠死亡率存在差异,BALB/c为70%,ICR为50%,NIHSwiss为40%,C57BL/6为25%,KMSwiss为10%;③病毒分离:各组接毒小鼠在死亡后均进行了病毒分离,死亡小鼠的肺脏均分离到病毒,其他脏器未分离到病毒。④病理变化:实验期间五个品系死亡小鼠肺脏病理改变相近。大体观:死亡小鼠肺部淤血,呈暗红色,体积增大,局部肺组织实变。镜下观:死亡小鼠的共同病理改变为间质性肺炎,具体表现为肺泡腔及间质出血、炎性细胞浸润;间质增生,肺泡隔增宽;肺泡腔中见纤维素性渗出,透明膜形成。⑤免疫组化结果 :在死亡小鼠的气管上皮细胞和肺巨噬细胞可观察到H5N1禽流感病毒阳性表达。结论小鼠作为H5N1禽流感病毒模型具有普适性,不同品系小鼠感染鹅源H5N1禽流感病毒的临床症状、病程和病理变化与人禽流感病例相似。不同品系小鼠的死亡比例有明显差别,可以根据不同的实验目的 ,选择不同品系的小鼠制作H5N1禽流感动物模型。不同品系的遗传特性对禽流感易感性产生明显的影响,遗传背景可能与H5N1禽流感病毒感染应答机理存在联系:BALB/c和C57BL/6均为近交系,其中BALB/c小鼠的品系特征之一表现为干扰素产量低,接种H5N1病毒后表现为高死亡率(70%),而C57BL/6小鼠的干扰素产量高,接种H5N1病毒后表现为低死亡率(25%),提示不同遗传背景小鼠的干扰素水平与H5N1感染致死具相关性。为进一步研究H5N1禽流感病毒易感性相关基因以及其与宿主免疫反应的关系提供了一个研究基础。     

汉滩病毒核蛋白的分段表达及抗原表位分析

在大肠杆菌中对汉滩病毒S基因4种不同长度片段的重组表达质粒进行诱导表达.结果表明表达的4种GST-NP融合蛋白均以不溶性包含体形式存在于菌体细胞内,表达量分别占菌体蛋白总量的29-36%,分子量分别约为72 kD、66 kD、54 kD和44 kD.Western blot显示54 kD和72 kD融合蛋白用酶标抗汉滩病毒NP McAb 1A8和抗GST McAb 3C11染色呈阳性反应.66 kD和44 kD融合蛋白仅与酶标3C11呈阳性反应.用凝血酶切去GST,获得4种汉滩病毒重组核蛋白(rNP),分子量分别约为44 kD、40 kD、26 kD和16 kD.用19株McAb对表达产物做抗原位点分析,结果完整的rNP可与19株McAb中的13株反应,McAb反应谱与天然NP相同;S1.1 kb表达产物(N-端1-37和C端402-429位aa缺失)和S 0.5 kb表达产物(N-端1-274位aa缺失)与19株McAb均不发生反应;S0.7 kb表达产物(C-端275-429位aa缺失)可与5株组特异性McAb反应.表明汉坦病毒核蛋白上的抗原位点主要存在于N-端1-37位aa区段内.     

H5N8亚型高致病性禽流感病毒的全球流行概况

H5N8亚型高致病性禽流感病毒(highly pathogenic avian influenza virus,HPAIV)随候鸟的迁徙活动及商业贸易活动现已蔓延至亚洲、欧洲、非洲、美洲等国家和地区.2014-2015和2016-2019年H5N8亚型HPAIV已引发两波全球疫情,现正经历第三波疫情,导致家禽及野生鸟类...     

不同免疫状态的小鼠对禽流感病毒H5N1感染的敏感性及其机制探讨

目的 比较不同免疫状态的小鼠对禽流感病毒的易感性,并探讨可能的原因.方法 四种免疫状态的小鼠,无菌BALB/c小鼠,SPF级BALB/c小鼠,SCID小鼠和nude小鼠,以10TCID50的禽流感病毒50μL感染小鼠,观察小鼠的体重变化,存活率,各组织脏器的病毒分布,肺组织的细胞因子变化和肺组织病理病变.结果 四种小鼠均能感染禽流感病毒,其中,无菌小鼠对禽流感病毒H5N1的易感性最低,存活率最高.并且病毒在无菌鼠体内病毒的复制水平最低,细胞因子TNF-α,IL-12,MIP2,GATA3,IFN-a/β在感染后表达水平最低,其中第7天最低.结论 无菌小鼠能感染禽流感病毒,但是相比较SPF级BALB/c小鼠,SCID小鼠和nude小鼠,其易感性最低,可能与病毒在组织内的低复制和细胞因子的低表达均有关.     

H5N1亚型AIVHA抗原表位的高效表达及其抗原活性分析

血凝素(hemagglutinin,HA)蛋白是禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)的一个重要表面抗原性蛋白,在疾病诊断和防治上有重要意义。本研究为了探讨一种更为简便有效的HA重组蛋白表达途径,利用生物信息学软件,对H5N1亚型AIVHA基因编码的氨基酸序列进行分析,在分析其在大肠杆菌中的密码子偏好性、稀有密码子分布情况及有关蛋白的抗原性等重要特性后,构建了HA抗原表位重组表达质粒pET-32a(+)-HA。经测试,该重组质粒在1mmol/LIPTG诱导剂作用下诱导过夜,能在大肠杆菌Rosetta-gami B(DE3)中高效表达,并得到48.1kD大小的目的重组表达蛋白。重组蛋白用6×His-tagged protein纯化试剂盒纯化后,与福氏佐剂等量混合制备成抗原,以200μg/鸡的剂量皮下注射2月龄SPF鸡3次,采血分离血清。Western-Blot试验结果表明,该重组表达蛋白能分别与所制备的高免鸡血清及H5N1亚型AIV阳性血清发生特异性反应,在硝酸纤维素膜上出现特异性杂交带。说明本试验研究的HA抗原重组表达蛋白具有良好的免疫原性和反应原性,保留了HA蛋白的抗原活性,提示该重组蛋白在H5亚型AIV的防治技术研究中具有重要的实际应用价值。     

H5N1亚型禽流感病毒NS第263—277位核苷酸缺失提高病毒对鸡的致病力

为研究2000年以来绝大多数H5N1亚型禽流感病毒分离株在非结构基因的第263—277位发生15个碱基缺失现象的生物学意义,构建H5N1A／D／SD／04株HA、NA、NS的全基因表达／转录载体,以及NS的删除突变载体（m248）,A/D/YZ/04株的NS基因表达／转录载体（848）和其补加15个核苷酸的NS突变载体（m848）。构建的载体分别与编码WSN（H1N1）内部基因载体进行组合转染,拯救获得4个具不同NS的重组的H5N1亚型流感病毒：RWSN-848和RWSN—m248在263-277位缺失15个碱基。RWSN-m848和RWSN-248则在相同位置不发生缺失。4个重组病毒的平均鸡胚繁殖效价（HA）、鸡胚的平均死亡时间（MDT）和鸡胚半数感染量（EID50）均无显著差异;但RWSN-848和RWSN-m248对6周龄SPF鸡的致病力明显高于RWSN—m848和RWSN-248。结果说明H5N1的NS基因在263～277位核苷酸发生缺失后,不影响重组H5N1在鸡胚中的繁殖性能,但提高了病毒对鸡的致病力。     

一株人感染高致病性禽流感(H5N1)病毒基因组分子特征分析

【背景】H5N1禽流感病毒可以感染人类导致重症呼吸道感染,致死率高。【目的】研究我中心确认的一例人感染高致病性禽流感H5N1病毒A/Nanjing/1/2015的可能起源及基因组分子特征。【方法】对病人痰液样本中的H5N1病毒进行全基因组测序,使用CLC Genomics Workbench 9.0对序列进行拼接,使用BLAST和MEGA 5.22软件进行同源性比对和各片段分子特征分析。【结果】该株禽流感病毒属于H5亚型的2.3.2.1c家系,其8个片段均与江浙地区禽类中分离的病毒高度同源,未发现有明显的重配。分子特征显示,该病毒血凝素(Hemagglutinin,HA)蛋白裂解位点为PQRERRRR/G,受体结合位点呈现禽类受体特点,但出现D94N、S133A和T188I氨基酸置换增强了病毒对人类受体的亲和性。神经氨酸酶(Neuraminidase,NA)蛋白颈部在49-68位缺失20个氨基酸,非结构蛋白1 (Non-structure protein,NS1)存在P42S置换和80-84位氨基酸的缺失。其他蛋白中也存在多个增强病毒致病力和对人类细胞亲和力的氨基酸突变。对耐药位点分析发现存在对奥司他韦的耐药突变H_274Y,病毒对金刚烷胺仍旧敏感。【结论】人感染高致病性禽流感H5N1病毒A/Nanjing/1/2015属于2.3.2.1c家系,禽类来源,关键位点较保守,但仍出现了多个氨基酸的进化与变异使其更利于感染人类。H5N1禽流感病毒进化活跃,持续动态监测不能放松。     

H5N1重组禽流感病毒样颗粒免疫原性研究

目的对构建的H5N1重组禽流感病毒样颗粒(VLPs)进行初步免疫原性探讨,并与H5N1全病毒灭活疫苗(WIV)进行体液免疫和细胞免疫的比较。方法在0周和3周分别以纯化H5N1重组禽流感病毒样颗粒、H5N1全病毒灭活疫苗及pH7.2 PBS腿部肌肉注射BALB/c小鼠,于不同时间收集血清,以血凝抑制试验(HI)和血清IgG抗体酶联免疫吸附试验(ELISA)评估体液免疫,CD4+、CD8+T细胞亚群及酶联免疫斑点试验(ELISPOT)评估细胞免疫,并以同型毒株滴鼻攻击,观察小鼠存活率。结果病毒样颗粒各组和全病毒灭活疫苗免疫后小鼠血清ELISA IgG效价均有升高;中和抗体效价除病毒样颗粒120 ng/只免疫剂量外其他免疫小鼠HI效价均达1︰40;小鼠脾CD4+T淋巴细胞亚群分类:全病毒灭活疫苗组(600μg/只)为36.56%;病毒样颗粒组(120 ng/只,600 ng/只,2 500 ng/只)分别为26.58%,32.20%,29.25%;PBS组为26.65%;CD8+T淋巴细胞亚群分类:全病毒灭活疫苗组(600 ng/只)为10.78%;病毒样颗粒组(120 ng/只,600 ng/只,2 500 ng/只)分别为1 3.53%,14.24%,1 3.35%;PBS组为10.69%。ELISPOT试验统计学数据显示,病毒样颗粒和全病毒灭活疫苗的小鼠脾单个核细胞分泌IFN-γ细胞与PBS组有显著性差异;小鼠保护性试验结果显示,除病毒样颗粒120 ng/只免疫剂量小鼠的存活率为87.5%外,其他病毒样颗粒实验组小鼠均为100%,PBS对照组为12.5%。结论 H5N1重组禽流感病毒样颗粒能诱导体液免疫和细胞免疫,并能抵御同型病毒株的攻击,可作为H5N1人用禽流感的候选疫苗。     

Localization Analysis of Heterophilic Antigen Epitopes of H1N1 Influenza Virus Hemagglutinin

Previous studies have indicated that two monoclonal antibodies(mAbs; A1-10 and H1-84) of the hemagglutinin(HA)antigen on the H1 N1 influenza virus cross-react with human brain tissue. It has been proposed that there are heterophilic epitopes between the HA protein and human brain tissue(Guo et al. in Immunobiology 220:941–946, 2015). However,characterisation of the two mAbs recognising the heterophilic epitope on HA has not yet been performed. In the present study, the common antigens of influenza virus HA were confirmed using indirect enzyme-linked immunosorbent assays and analysed with DNAMAN software. The epitopes were localized to nine peptides in the influenza virus HA sequence and the distribution of the peptides in the three-dimensional structure of HA was determined using PyMOL software. Key amino acids and variable sequences of the antibodies were identified using abYsis software. The results demonstrated that there were a number of common antigens among the five influenza viruses studied that were recognised by the mAbs. One of the peptides, P2(LVLWGIHHP191–199), bound both of the mAbs and was located in the head region of HA. The key amino acids of this epitope and the variable regions in the heavy and light chain sequences of the mAbs that recognised the epitope are described. A heterophilic epitope on H1 N1 influenza virus HA was also introduced. The existence of this epitope provides a novel perspective for the occurrence of nervous system diseases that could be caused by influenza virus infection, which might aid in influenza prevention and control.     

虎源H5N1亚型禽流感病毒感染小鼠模型的建立

为研究H5N1亚型禽流感病毒的病原特性、致病机理及对其疫苗与救治药物效果评价提供平台,利用本室分离鉴定的虎源A/Tiger/Harbin/01/2002株(简称HAB/01)H5N1亚型禽流感病毒进行连续10倍稀释后,对4～6周龄雄性BALB/c小鼠经乙醚麻醉后进行滴鼻攻毒,每个稀释度接种10只实验小鼠,测定其MLD50,检测小鼠感染、致病的多项指标,观察期为14d。结果感染小鼠呈现出规律的以肺炎为主的临床症状、病理变化及病死率;测得该病毒对小鼠的MLD50为10-7.1/0.05mL。成功建立了虎源H5N1亚型禽流感病毒感染BALB/c小鼠的实验模型。     

虎源H5N1亚型禽流感病毒感染小鼠模型的建立

为研究H5N1亚型禽流感病毒的病原特性、致病机理及对其疫苗与救治药物效果评价提供平台,利用本室分离鉴定的虎源A/Tiger/Harbin/01/2002株(简称HAB/01)H5N1亚型禽流感病毒进行连续10倍稀释后,对4～6周龄 雄性BALB/c小鼠经乙醚麻醉后进行滴鼻攻毒,每个稀释度接种10只实验小鼠,测定其MLD50,检测小鼠感染、致病的多项指标,观察期为14d.结果感染小鼠呈现出规律的以肺炎为主的临床症状、病理变化及病死率;测得该病毒对小鼠的MLD50为10-7.1/0.05mL.成功建立了虎源H5N1亚型禽流感病毒感染BALB/c小鼠的实验模型.     

H5N1型禽流感病毒核蛋白C端缺失削弱核蛋白间的相互作用

目的：克隆H5N1型禽流感病毒的核蛋白（NP）基因,将其定向插入双分子荧光载体,在细胞水平验证NP-NP的相互作用,进而确定NP-NP相互作用的关键区域。方法：根据双分子荧光互补（BiFC）实验的载体和NP基因序列设计引物,将NP的结构基因定向克隆到荧光载体上,得到重组荧光载体pBiFC-YC155-NP、pBiFC-YN155-NP、pBiFC-YC173-NP和pB-iFC-YN173-NP,瞬时转染293FT细胞,研究NP-NP相互作用;进一步对NP的C端进行缺失突变,然后定向克隆到pBiFC-YN173载体,令其分别与pBiFC-YC155-NP共转染293FT细胞,确定NP的C端在NP-NP相互作用过程中的地位。结果：构建了NP基因的BiFC载体pBiFC-YC155-NP、pBiFC-YN155-NP、pBiFC-YC173-NP和pBiFC-YN173-NP;将pBiFC-YC155-NP和pBiFC-YN173-NP、pBiFC-YC173-NP和pBiFC-YN173-NP共转染293FT细胞后出现了荧光;缺失实验表明,NP的C端是NP在体内相互作用形成寡聚体所必需的。结论：验证了H5N1型禽流感病毒NP在体内的相互作用,并初步证明NP的C端是NP形成寡聚体的必需片段,为进一步研究NP的作用奠定了基础。     

H5N1禽流感病毒对C57BL／6小鼠的致病性研究

本试验利用虎源H5N1禽流感病毒对6～8周龄雌性C57BL/6小鼠进行滴鼻感染,观测小鼠临床症状和组织病理变化,于感染后第3d和第5d每组分别处死3只小鼠,测定肺、脑、脾、肾、肝组织中的病毒含量;并测定该病毒对C57BL/6小鼠的MLD50。结果表明感染小鼠出现精神不振、体重下降、支气管炎和间质性肺炎为主的临床症状和病理变化;测得感染后小鼠肺脏中病毒拷贝数和病毒滴度最高,其次是脑、肾、脾、肝等组织;该病毒对C57BL/6小鼠的MLD50为10-6.5/0.05mL。此研究成功进行了H5N1禽流感病毒对C57BL/6小鼠的感染,可以作为感染模型进行H5N1禽流感病毒的发病机制、疫苗评价、药物筛选等研究。     

禽流感H5N1型病毒对沙鼠致病性的初步研究

[目的]观察禽流感H5N1型病毒对沙鼠的致病性;[方法]在生物安全三级实验室,将禽流感H5N1型病毒通过滴鼻接种乙醚麻醉后沙鼠,观察14天,记录沙鼠的体温体重、临床症状、病理变化、病毒分离及抗体变化;[结果]沙鼠感染后发病主要表现在第2天至第6天,攻毒组沙鼠出现反应迟钝、皱毛、弓背、食欲下降、呼吸急促、打堆等症状,攻毒组沙鼠的体温降低和体重减轻,死亡率为44%,在第8天检出抗体,主要病理变化表现为肺出现严重淤血、水肿、出血,镜下可见肺间质充血,血管周围炎性细胞浸润,肝和胸腺淤血,肾出血,肾小管变形。     

表达人高致病性禽流感病毒H5N1(安徽株)结构基因的DNA疫苗在小鼠中诱导的免疫应答分析

本研究旨在研发经济、高效的人高致病性禽流感病毒H5N1实验疫苗并优化免疫方案。首先优化并合成H5N1(安徽株)的血凝素基因(HAop)和神经氨酸酶基因(NAop)并证实其正确表达,再构建含有H5N1(安徽株)结构基因的多个单顺反子(HAwt、HAop和NAop)和双顺反子(HAop/M2和NAop/M1)DNA疫苗质粒。随后,采用不同途径的体内电转法在第0周和第3周2次免疫Balb/C小鼠,初步分析了抗原特异性体液免疫(HA血凝抑制抗体,NA特异性抗体,中和抗体)和细胞免疫应答(IFN-γELISpot)的特点。结果表明:含有优化血凝素基因(HAop)和优化神经氨酸酶基因(NAop)的DNA疫苗可以快速激发较强的免疫应答,尤其是细胞免疫应答;皮内电转所激发的体液免疫应答强于肌肉电转。本研究为新型H5N1疫苗的研发以及免疫方案的优化奠定了基础。