低压脉冲电泳介导的外源基因转化部分酶解的水稻小细胞团

开发了一类新型的低压脉冲电泳法介导外源基因进入水稻细胞的转化系统。本系统以水稻部分酶解小细胞团为受体,采用低压脉冲电泳推动质核DNA进入水稻细胞。以报告基因GUS酶活性为指标,借以测定转化了的水稻细胞。最佳的组合处理可以获得8.2％的转化频率。文中对低压脉冲电泳转移外源基因的条件亦作了讨论。     

低压脉冲电泳介导的外源基因转化部分酶解的水稻小细胞团

开发了一类新型的低压脉冲电泳法介导外源基因进入水稻细胞的转化系统。本系统以水稻部分酶解小细胞团为受体，采用低压脉冲电泳推动质核DNA进入水稻细胞。以报告基因GUS酶活性为指标，借以测定转化了的水稻细胞。最佳的组合处理可以获得8．2％的转化频率，文中对低压脉冲电泳转移外源基因的条件亦作了讨论。     

玉米、小麦、水稻原生质体制备条件优化

玉米Zea mays L.、小麦Triticum aestivum L.、水稻Oryza sativaL.是三大重要粮食作物,对其原生质体制备条件的优化具有重要意义.以玉米(综3)、小麦(中国春)、水稻(日本晴)10日龄幼苗为材料,研究了叶肉细胞原生质体分离过程中的酶浓度、酶解时间和离心力大小等因素对产量和活力的影响.结果表明:酶浓度和酶解时间对原生质体产量影响显著,随着酶解液浓度和酶解时间的提高,原生质体产量增加,但细胞碎片同时增多.水稻经真空处理后,原生质体产量大幅度提高.通过正交实验设计得出如下结果:玉米叶肉细胞原生质体分离的最佳条件为:纤维素酶1.5％,离析酶0.5％,50 r/min酶解7h,100×g离心2 min收集,原生质体产量为7×106/g FW;小麦叶肉细胞原生质体分离的最佳条件为:纤维素酶1.5％,离析酶0.5％,50 r/min酶解5h,100×g离心2 min收集,原生质体产量为6×106/g FW;水稻叶肉细胞原生质体分离的最佳条件为:纤维素酶2.0％,离析酶0.7％,50 r/min酶解7h,1 000×g离心2 min收集,得到的原生质体产量为6×106/g FW.通过二乙酸荧光素染色发现原生质体活力均在90％以上.用PEG-Ca2+介导法将含有绿色荧光蛋白的质粒转化入原生质体,转化率可达50％ ～80％.     

雷公藤悬浮细胞原生质体的制备及瞬时转化体系的建立

为探索药用植物雷公藤(Tripterygium wilfordii)悬浮细胞原生质体提取的最优条件,并建立雷公藤原生质体瞬时转化体系,以雷公藤悬浮细胞为材料,对酶解液配比、酶解时间、甘露醇浓度及处理转速进行考察。用PEG介导的瞬时转化法将外源基因转化到雷公藤原生质体中。结果表明,以雷公藤悬浮细胞为材料提取原生质体的最佳条件是酶液配比为2.0%纤维素酶+0.5%果胶酶+0.5%离析酶,甘露醇浓度为0.6 mol·L–1,酶解10小时,处理转速为67×g;用PEG介导法将含有编码GFP的植物表达载体转化雷公藤悬浮细胞原生质体,激光共聚焦扫描显微镜下细胞显示绿色荧光。通过实验筛选得到雷公藤悬浮细胞原生质体的最佳提取条件,建立了雷公藤悬浮细胞原生质体的瞬时转化体系,为进一步开展雷公藤功能基因及合成生物学研究奠定了基础。     

棉花原生质体再生小植株

80年代植物原生质体培养取得突破性进展,水稻、小麦、玉米和大豆等重要农作物先后获得再生植株。但棉花原生质体培养至今仍停留在细胞分裂和形成细胞团阶段,原生质体培养得到愈伤组织仅有一例。本文首次报道从陆地棉柯字棉312品种的细胞悬浮培养系原生质体培养获得再生小植株的试验结果。     

野大麦幼穗原生质体的分离和培养

以野大麦(Hordeum brevisubulatum)的幼穗诱导愈伤组织,建立悬浮细胞系,利用胚性悬浮细胞系在不同的酶解条件和不同的酶解液中分离原生质体并进行培养,获得了细胞分裂,形成细胞团。     

野大麦幼穗原生质体的分离和培养

以野大麦（Ｈｏｒｄｅｕｍｂｒｅｖｉｓｕｂｕｌａｔｕｍ）的幼穗诱导愈伤组织,建立悬浮细胞系,利用胚性悬浮细胞系在不同的酶解条件和不同的酶解液中分离原生质体并进行培养,获得了细胞分裂,形成细胞团。     

“红颜”草莓原生质体制备及瞬时转化体系的建立

为探索“红颜”草莓悬浮细胞系原生质体提取的最优条件,并建立“红颜”草莓原生质体瞬时转化体系,以“红颜”草莓悬浮细胞为材料,对酶液组成、酶解温度、酶解方式进行研究。用PEG介导的瞬时转化法将标记基因GFP转化到“红颜”草莓原生质体中。结果显示：以“红颜”草莓悬浮细胞系作为分离材料,酶液组合为CPW中含有0.5%PVP+0.1%MES+1%纤维素酶+0.5%离析酶+0.01%半纤维素酶+0.9 mol/L甘露醇,在低速（50 r/min）恒温（31 ℃）震摇下进行酶解反应,酶解10 h时,达到“红颜”草莓原生质体最佳分离效果,每克鲜重产量可得原生质体6×10⁸ 个,活力值可达93.0%。PEG介导法成功将含有绿色荧光蛋白（green fluorescent protein, GFP）的植物表达载体转化“红颜”草莓悬浮细胞原生质体,转化效率达44%。通过实验筛选得到“红颜”草莓悬浮细胞原生质体的最佳制备条件,建立“红颜”草莓悬浮细胞原生质体的瞬时转化体系,为进一步开展“红颜”草莓功能基因及合成生物学研究奠定基础。     

梭梭原生质体快速制备方法的建立及其在亚细胞定位中的应用

梭梭是中国西北荒漠半荒漠地区防沙治沙首选建群树种。目前梭梭蛋白亚细胞定位采用洋葱表层细胞以及鹰嘴豆和拟南芥原生质体等进行,但采用不同体系进行亚细胞定位,可能会出现不同结果,这与同源或异源表达的植物细胞特性有关。因此,梭梭蛋白采用其原生质体进行亚细胞定位结果更真实可信。通过对酶种类及配比、质壁分离时间、酶解液pH、酶解时间等的优化,本研究拟建立梭梭原生质体快速制备方法,并探讨其在亚细胞定位中的应用。结果表明:以2～3 cm长的幼嫩同化枝,置于pH值5.6的CPW酶解液(10%甘露醇, 0.1%MES, 1.0%纤维素酶, 0.4%离析酶)中,黑暗条件下27℃恒温水浴45 r/min酶解10～11 h,为梭梭原生质体快速制备最佳条件,原生质体产量可达0.41×10~7个/g·FW,存活率为70.32%;所得原生质体应用于亚细胞定位研究效果良好。本制备方法可应用于梭梭原生质体培养、细胞研究、基因瞬时表达等领域。     

从水稻原生质体再生小植株

水稻原生质体培养方面的工作很多。大多数实验是用已分化的细胞可以诱导第一次分裂,甚至小细胞团和形成愈伤组织。但是,迄今为止未见水稻原生质表1 a.愈伤组织年龄对于原生质体得率的影响。b.原生质体的发育。c.三次实验的再生率。体培养,再生成植株的成功报告。用水稻栽培品种“Moroberekan”灭菌后接种在经修改的 MS 固体培养基上,2,4-D(2 mg/l),     

贡蕉胚性悬浮细胞原生质体分离的研究

目的:研究不同方法对贡蕉胚性悬浮细胞原生质体分离的影响,筛选适合用于贡蕉胚性悬浮细胞原生质体分离的方案.方法:用不同的酶浓 度、酶组合及不同的酶解时间对贡蕉胚性悬浮细胞进行原生质体分离,并对不同继代时间的胚性悬浮细胞的原生质体产量和活力进行研究.结果:贡蕉胚性悬浮细胞 在酶组合为3.5%纤维素酶R-10、1%离析酶R-10和0.15%果胶酶Y-23的酶溶液中,酶解8h可获 得高产量的原生质体,采用继代7d的贡蕉胚性悬浮细胞进行原生质体分离时获得的原生质体产量最高,达到1.2×107个/mL PCV ECS,原生质体活力达到85%以上.结论: 合适的酶组合、酶浓度和酶解时间有利于贡蕉胚性悬浮细胞的原生质体分离,继代7d 后的贡蕉胚性悬浮细胞最适合用于原生质体分离.     

利用荧光染色和流式细胞技术辅助卵孢小奥德蘑原生质体制备与再生研究

本研究以卵孢小奥德蘑液体培养菌丝作为实验材料,利用单因子变量法探索研究了菌丝培养时间、酶浓度、酶解时间、酶解温度、稳渗剂类型对卵孢小奥德蘑原生质体制备的影响,并对原生质体再生培养基进行选择和优化。通过荧光染色,利用激光共聚焦显微镜和流式细胞仪对原生质体的制备过程、得率和活力进行研究。结果表明,将卵孢小奥德蘑菌丝在液体培养基中培养5d收集菌丝体,以甘露醇作为渗透压稳定剂,在溶壁酶浓度2%、30℃条件下酶解5h,获得的原生质体得率最高,达2.0×10 ⁷个/mL;通过流式细胞仪分析,约57.69%的原生质体细胞为活细胞;在RM培养基中再生效果最好,再生率为(0.103±0.025)%。研究结果可以为卵孢小奥德蘑育种与食用菌原生质体制备再生提供研究基础。     

谷子原生质体的分离和培养(简报)

取继代培养后4—5天的谷子(Setariaitalica,品种豫谷一号)悬浮培养细胞,用含2%纤维素酶(Onozuka Rs)和0.1%果胶酶(Pectolyase Y 23)的酶溶液酶解分离原生质体。原生质体纯化后的产量在2—6×10~6原生质体/克鲜重。原生质体在培养2天后形成细胞壁并开始进行分裂。在培养6天时的分裂频率达5—12%。此后随添加新鲜培养基并降低培养基的渗透压,形成细胞团。培养一个月后,可将可见的细胞团转移到附加2,4-D和激动素的MS琼脂培养基上,即形成旺盛生长的愈伤组织。     

植物原生质体培养

六十年代初英国植物生理学家 Cocking首先用酶解方法降解细胞壁,获得了蕃茄根尖细胞的原生质体。由于酶解方法能获得遗传性状和生理性状较一致的原生质体群体,为从植物细胞获得大量原生质体开辟了新的途径,并已为国内外科研工作者广泛采用。现用酶解法     

拟南芥叶片细胞包被系统酸性降解的光镜观察

观察了拟南芥叶片细胞包括细胞壁和质膜在内的细胞包被系统在酸性条件下酶促降解的过程。观察发现,处于酸性酶解液中的拟南芥叶片,最初细胞壁完整,细胞排列有序,其后细胞壁开始部分降解,细胞排列逐渐进入无序状态,随后细胞壁完全降解,去壁的原生质体完全进入游离状态,游离原生质体的质膜也随之降解,细胞器溢出后以细胞核为核心积聚、重组为新的原生质体。进一步观察了这一过程中细胞pH值的改变,结果发现,酸性酶解过程中细胞倾向于pH值降低,而细胞器重组产生的新原生质体pH值向正常水平恢复。因此,酸性环境对拟南芥叶片细胞包被系统的降解产生重要的影响。     

抗坏血酸对花生原生质体分离过程中膜损伤的保护作用

酶解处理使花生叶肉细胞原生质体膜脂质过氧化产物丙二醛(MDA)积累,添加抗坏血酸(ASA)能降低MDA的积累。未添加ASA时,酶解初期,过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)活性上升,说明原生质体存在各种抵御不良变化的机制,但酶解时间加长,POD活性下降。添加ASA能使超氧化物歧化酶(SOD)活性明显上升。试验结果说明:在原生质体分离过程中会导致膜损伤,细胞自身存在一个响应的防御机制,添加ASA能降低酶解过程对原生质膜的损伤。     

葡萄原生质体分离及瞬时转化体系的建立

为了建立葡萄原生质体进行遗传转化的技术,该研究以葡萄品种‘黑香蕉’的叶片和愈伤组织为材料,分析纤维素酶和离析酶的浓度与配比、渗透压和酶解时间等主要因素对葡萄原生质体分离的影响,探讨建立稳定、高效的葡萄原生质体分离与瞬时转化体系,为鉴定目标基因的功能奠定基础。结果表明:(1)葡萄叶片原生质体的分离以3.0%纤维素酶和0.75%离析酶的酶组合,在0.6mol/L甘露醇溶液中,酶解14h为宜,每克游离产量为4.09×106个原生质体,活力为83.12%。(2)葡萄愈伤组织原生质体的分离以2.0%纤维素酶和0.5%离析酶的酶组合,在0.5mol/L甘露醇溶液中,酶解14h为宜,每克游离产量为6.05×106个原生质体,活力为84.13%。(3)利用该方法得到的葡萄原生质体为受体,采用40%PEG-4000介导转化质粒载体pEZS-NL,目标基因瞬时表达产物检测表明,GFP蛋白表达稳定、清晰。该研究建立的葡萄原生质体制备和转化体系,可以用较少量的质粒DNA获得外源基因在原生质体内的表达,为葡萄功能基因的研究提供技术支持。     

拟南芥叶肉原生质体分离条件的优化研究

以野生型拟南芥(Arabidopsis thaliana,ecotype Columbia)无菌苗为材料,研究了叶肉原生质体分离过程中的预处理条件、酶解方式、酶解温度和离心力大小等因素对产量和活力的影响.结果表明,酶解方式和酶解温度对原生质体产量影响显著,28℃静置酶解14 h能够将原生质体产量提高6.32倍.低温预处理和离心力大小对原生质体活力影响显著,4℃低温预处理24 h能够将原生质体活力提高55%.适宜拟南芥原生质体叶肉细胞分离的最佳条件为:4℃低温预处理24 h,28℃静置酶解14 h,600 r·min-1离心3次,每次10 min,得到的原生质体产量为2.91×106个·g-1,活力为84.03%.     

‘过山香’香蕉胚性悬浮细胞原生质体分离的方法研究

目的：研究不同的方法对‘过山香’胚性悬浮细胞原生质体分离的影响,筛选最适合用于‘过山香’香蕉胚性悬浮细胞原生质体分离的方案。方法：用不同浓度、不同组合的酶液对‘过山香’原生质体进行分离,并对酶液的甘露醇含量、pH值进行调节。结果：3．0％纤维素酶R-10＋0．2％果胶酶Y-23的是最佳酶组合;酶解8h、酶液中含0．41M甘露醇、酶液pH值为5．3时,获得原生质体产量最高。结论：合适的酶组合、酶解时间、酶液的渗透压和pH值对‘过山香’香蕉胚性悬浮细胞原生质体的分离有明显的促进作用。     

不同冻存条件对甘蔗原生质体活力和再生能力的影响

为了获得活力高和再生能力强的甘蔗原生质体,该文对甘蔗原生质体的冻存液浓度、冻存温度和冻存部位进行了研究。结果表明:(1)不同的冻存液、不同的冻存温度和不同的取材部位原生质体冻存后复苏对甘蔗原生质体的活力影响有显著差异性,三个冻存液组合比较,在组合2(70%培养基+20%血清+10%DMSO),冻存30 d后复苏活力最强,高达72%;冻存90 d内复苏,-196℃液氮和-80℃冰箱冻存,甘蔗原生质体的活力差异不显著,活力均在75%以上,但90 d冻存后复苏,-196℃液氮冻存后复苏比-80℃冰箱冻存冻存后复苏原生质活力强;不同取材部位比较,幼叶冻存30 d后复苏所得原生质体活力较高(达79. 2%),茎尖冻存30 d后复苏所得原生质体活力仅为42.7%。(2)不同的冻存液和不同的冻存温度,细胞第一次启动分裂和形成细胞团的时间差异不显著,一般培养5～6 d,细胞壁基本形成完整,培养6 d后,细胞启动分裂,培养15 d后形成细胞团。不同的材料部位相比较,茎尖酶解所得原生质体再生能力最强,较幼叶酶解原生质体,形成细胞壁的时间早3 d,第一次分裂时间早2 d。