TNF-α作用的两面性

ＴＮＦ┐α作用的两面性细胞凋亡是否存在保护机制？最近Ｓｃｉｅｎｃｅ上发表了三篇文章从不同的角度证明,ＴＮＦ－α在诱导细胞凋亡的同时,可通过核因子κＢ（ＮＦ－κＢ）诱导某些蛋白以保护靶细胞免于死亡。因而,靶细胞的命运就取决于细胞内这两种机制的平衡。Ｂａ...     

TNF-α在癌症中的作用研究进展

肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α,TNF—OL）是具有多种生物学效应的细胞因子。机体内适量的TNF-α在抵抗病原菌和肿瘤防御中起着重要的作用,但当其超过一定量时,TNF-α与其他炎性因子一起反而能促进癌症的发生发展及产生多种病理性损伤。就TNF-α在癌症中的双重作用及其临床研究现状作一综述。     

TNF-α信号传导通路的分子机理

肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-alpha,TNF-α）是一种具有多效生物学效应的细胞因子.TNF的生物学效应都是通过细胞表面的2种TNF受体（TNFR）引发,其信号传导通路主要包括caspase家族介导的细胞凋亡、衔接蛋白TRAF介导的转录因子NF-κB和JNK蛋白激酶的活化.TNFR1和TNFR2的生物学功能不是独立的,许多生物学活性由二者共同完成.3条信号传导通路之间及各通路内部含有各种调节机制,使TNF的各种生物学功能协调发挥出来.本文评述了3条信号传导通路最新进展、关键激酶的研究状况及其在整个信号网络中的作用机理,如IKK的激活以及重要的信号转导分子RIP、TRAF2、TRUSS的结构、相互作用的方式等     

调节猪TNF-α表达的miRNAs鉴定

肿瘤坏死因子α(TNF-α)是脂肪细胞的分泌产物之一,在脂肪中行使着复杂的调节功能,为了研究猪脂肪组织中TNF-α的表达受到哪些miRNA的调控,从猪脂肪组织基因组中获得猪TNF-α3'端非翻译区(UTR)序列,与荧光素酶质粒PGL3-control连接构建猪TNF-α的萤光素酶表达质粒PGL3-TNF-α3'UTR。生物信息学预测miR-19a,miR-124,miR-130a,miR-301,miR-506等miRNAs均靶向猪TNF-α,将这些miRNA分别与PGL3-TNF-α3'UTR质粒共转到细胞中,以乱序序列作为阴性对照(NC),检测miRNA对质粒荧光素酶活性的作用。结果发现miR-19a,miR-124和miR-130a均能够显著抑制萤光素酶的活性(P0.01),为了验证这3个miRNA是否通过各自种子序列起调控作用,突变了PGL3-TNF-α3'UTR中这3个miRNA种子序列的结合位点,结果发现miRNAs对突变质粒中的荧光素酶均无明显抑制作用(P0.05)。结果证明,miR-19a,miR-124和miR-130a与猪TNF-α均有直接的靶向关系并通过各自种子序列抑制TNF-α的表达。     

转TNF-α基因大肠杆菌培养条件的优化

目的：优化转pMD-489-TNF大肠杆菌的发酵条件,提高菌体产量及TNF-α产率。方法：通过单因素及正交实验,对影响转基因大肠杆菌生长及TNF-α表达的培养液成分、诱导剂浓度、培养温度等工艺条件进行了优化。结果：M9＋LB培养基成分的最优配比为3%葡萄糖、2%蛋白胨、4%酵母粉和1%NH4Cl,诱导剂IPTG浓度为0.5mmol/L,诱导时间4h,培养液初始pH是7.0,于37℃培养。结论：优化后的培养条件促进了菌体的生长和TNF-α的表达,菌体干重和TNF-α表达率比没有经过优化时升高了1.34倍和4.11倍,TNF-α产率从0.113%提高到0.479%,提高了324%。     

抗TNF-α单链抗体的表达及其纯化

克隆抗人肿瘤坏死因子(TNF-α)鼠源单抗的可变区基因以构建其单链抗体(ScFv)表达载体,实现在大肠杆菌的表达,并进行ScFv的可溶性纯化与鉴定。采用RT-PCR技术,以前导肽序列的引物从1个分泌抗人TNF-α的鼠单抗杂交瘤细胞系中克隆抗体轻链、重链可变区基因(VL,VH),构建ScFv基因,将ScFv基因片段与pGEX-4T-1表达载体连接,在大肠杆菌中表达并采用十二烷基肌氨酸钠(Sarkosyl)进行可溶性纯化,最后鉴定其生物活性。结果显示,得到了功能性重排的轻、重链可变区基因,分别构建了VH和VL不同连接顺序的HLL(VH-Linker-VL)和LLH(VL-Linker-VH)两种ScFv,LLH的表达量较HLL的高,但亲和力不及HLL。采用Sarkosyl溶解包涵体,对目的蛋白进行可溶性纯化,蛋白纯度达到90%,纯化后的蛋白经ELISA和WB证明ScFv维持了亲本抗体与TNF-α特异性结合的能力,且具有细胞毒中和活性。实验中研究探索了一种新颖的,操作简单,省时的裂解、纯化方案,实现了单链抗体经原核系统的表达后得以可溶性纯化。     

TNF-α及其受体在格林巴利综合征中的作用

格林巴利综合征（Guillain-Barrésyndrome,GBS）是一种以周围神经和神经根的脱髓鞘及小血管周围淋巴细胞和巨噬细胞的炎性反应为病理特点的自身免疫性疾病。目前GBS的确切病因还不十分清楚,但是越来越多的研究表明,细胞因子在GBS的发生、发展过程中起到重要的作用,其中TNF-α及其受体在GBS的发病机制中更是扮演着重要的角色。本文就TNF-α及其受体在GBS发病过程中的作用进行综述。     

AMPK激活剂减轻TNF-α诱导的爆发性肝损伤

探讨腺苷酸活化蛋白激酶(AMP activated protein kinase,AMPK)激活剂A-769662对肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor alpha,TNF-α)诱导的爆发性肝损伤中肝细胞凋亡的影响及机制。本研究在雄性BALB/c小鼠经腹腔内注射肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor alpha,TNF-α)及D氨基半乳糖胺(D-galactosamine,D-Gal),诱导爆发性肝炎模型。实验分为4组:正常对照组、A-769662单独处理组、模型组和A-769662干预组。采用比色法检测血浆转氨酶活性及肝组织中caspase-8、caspase-9、caspase-3的相对活性,Western blotting法检测肝组织中激活型caspase-3蛋白水平,TUNEL法检测肝细胞凋亡,HE染色观察肝组织病理变化,并记录各组小鼠生存情况。A-769662干预抑制了TNF-α/D-Gal诱导的肝组织中caspase-8、caspase-9、caspase-3的活性和激活型caspase-3蛋白表达水平的升高,显著减少肝细胞凋亡数目,明显下调血浆中天冬氨酸氨基转氨酶(aspartate transaminase,AST)与丙氨酸氨基转氨酶(alanine transaminase,ALT)水平,减轻肝组织病理学改变,提高小鼠生存率。AMPK激活剂A-769662在TNF-α诱导的爆发性肝损伤中,可发挥抗凋亡保护效应,这可能是其在保肝效应的新机制。     

Nmp4促进TNF-α诱导的成骨细胞凋亡

核基质蛋白4(nuclear matrix protein4,Nmp4)是一种具有核质穿梭功能的结构性转录因子.主要通过负调控调节成骨细胞分化和增殖,抑制骨密度及骨量增加,而Nmp4是否调节成骨细胞凋亡,还未有相关报道.本课题通过分离Nmp4基因敲除(Nmp4-KO)和野生型(WT)小鼠原代成骨细胞,以肿瘤坏死因子(TNF-α)为凋亡诱导手段,研究了Nmp4对成骨细胞凋亡的影响及其作用机制.体外细胞实验发现,Nmp4-KO显著抑制TNF-α诱导的成骨细胞内caspase-3激活.Nmp4-KO促进细胞外信号调节激酶(Erk)和丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(Akt)信号途径的激活,抑制c-Jun氨基末端激酶(JNK)磷酸化,从而对抗成骨细胞凋亡.TNF-α诱导处理可增强成骨细胞核因子NFκB磷酸化及其核转位,但Nmp4基因缺失无进一步促进作用.未经诱导处理的Nmp4-KO细胞内NFκB磷酸化水平显著高于WT对照.此外,TNF-α诱导处理促使线粒体途径信号分子Bad磷酸化及Bcl-xl表达水平适当升高,但在两种细胞表型间无显著差异.这些结果证实,Nmp4基因敲除可促进相关抗凋亡信号分子的激活和表达,抑制促凋亡信号的激活,进而抑制成骨细胞凋亡的发生.     

睡眠剥夺上调小鼠胰腺TNF-α的表达

目的探讨睡眠剥夺对小鼠胰腺形态、功能的影响以及肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factorα,TNF-α)表达变化的病理意义。方法 C57雄性小鼠随机分为正常对照组,睡眠剥夺24 h、48 h和60 h组,观察各组小鼠的精神活动状态及体重变化;检测血清淀粉酶(serum amylase,AMS)水平;采用HE染色和免疫组织化学法观察各组小鼠胰腺的组织学特征及TNF-α表达情况;Western Blot检测TNF-α的表达水平。结果随睡眠剥夺时间的延长,模型组小鼠体重较正常对照组明显下降。AMS水平在睡眠剥夺24 h显著升高,48 h达到峰值后维持至60 h。HE染色可见睡眠剥夺组小鼠出现胰岛细胞排列紊乱、胞质浓缩、细胞间隙扩大;外分泌部细胞酶原颗粒消失,细胞空泡化等病理改变;免疫组化及免疫印迹显示,睡眠剥夺组小鼠胰腺中TNF-α的表达随剥夺时间的延长而明显上调。结论睡眠剥夺后不仅导致小鼠全身衰竭,并通过活化TNF-α而诱导胰腺的炎症反应,导致其形态和功能损伤。     

血清TNF-α与糖尿病微血管病变的关系

目的:研究肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-alpha;TNF-α)与糖尿病微血管病变的关系.方法:将67例糖尿病患者,通过是否合并微血管痛变,分成无微血管病变组(DMI组)32例,合并微血管病变组(DM2组)35例,设正常时照组25例对比,用放射免疫法测得血清TNF-α,三组间进行比较.测受检者总胆固醇、甘油三酯、空腹血糖、糖化血红蛋白等指标,三组间比较.结果:2型糖尿病患者肿瘤坏死因子-α水平显著高于正常对照组(P＜0.01),糖尿病合并微血管病变组较糖尿病无微血管病变组其表达也明显升高(P＜0.01).结论:TNF-α表达的上调可能与糖尿病微血管病变的发生、发展关系密切     

两步串联层析法纯化抗TNF-α单克隆抗体

旨在建立从重组CHO细胞发酵培养液中纯化抗TNF-α单克隆抗体的两步串联层析法。将含有抗TNF-α单克隆抗体的料液经两次离心、一步过滤的预处理后,用protein A填料捕获,阳离子填料Sourec30精细纯化。精细纯化过程中利用Do E的方法,采用CCF(Central composite face)设计,探讨了洗脱p H值及盐浓度对纯化的影响。纯化后的抗TNF-α单克隆抗体经HPLC以及毛细管电泳,检测其浓度、纯度以及多聚体含量。结果显示,亲和层析的最佳洗脱条件为p H4.0。通过DOE优化,为达到质量目标(回收率90%以上,纯度97%以上,多聚体0.3%),筛选出最佳洗脱范围为0.05-0.13 mol/L Na Cl以及p H5.7-6.0,选定p H6.0与0.10mol/L Na Cl作为Source洗脱条件,此时回收率94.3%,纯度97.3%,多聚体0.3%,其质量与参比制剂接近。     

TNF-α在抑郁症中的作用和机制研究

抑郁症是一种情感精神疾病,临床上以显著而持久的心境低落为主要特征。抑郁症严重危害人们身心健康,降低生活质量,增加社会负担。抑郁的产生原因比较复杂,发病机制存在多种假说。在过去的几十年,虽然对于抑郁症的研究取得了一定的进展,但其确切的病因及病理生理机制目前仍不明确。近期,研究显示,促炎性细胞因子,尤其是肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)在抑郁症的发生、发展及临床药理机制中扮演着重要角色。现通过对TNF-α的生物学特征、在抑郁症发病和抗抑郁治疗中的作用、基因多态性与抑郁症关联性以及未来的应用与展望等进行综述,以期从多方面阐明TNF-α在抑郁症中的作用。     

Dynamic quantitative proteomics characterization of TNF-α-induced necroptosis

Emerging evidence suggested that necroptosis has essential functions in many human inflammatory diseases, but the molecular mechanisms of necroptosis remain unclear. Here, we employed SILAC quantitatively dynamic proteomics to compare the protein changes during TNF-α-induced necroptosis at different time points in murine fibrosarcoma L929 cells with caspase-8 deficiency, and then performed the systematical analysis on the signaling networks involved in the progress using bioinformatics methods. Our results showed that a total of 329, 421 and 378 differentially expressed proteins were detected at three stages of necroptosis, respectively. Gene ontology and ingenuity pathway analysis (IPA) revealed that the proteins regulated at early stages of necroptosis (2, 6 h) were mainly involved in mitochondria dysfunction, oxidative phosphorylation and Nrf-2 signaling, while the expression levels of the proteins related to ubiquitin, Nrf-2, and NF-κB pathways were found to have changes at last stages of necroptosis (6, 18 h). Taken together, we demonstrated for the first time that dysfunction of mitochondria and ubiquitin–proteasome signaling contributed to the initiation and execution of necroptosis. These findings may provide clues for the identification of important regulators in necroptosis and the development of novel therapeutic strategies for the related diseases.     

TNF-α拮抗肽拮抗机制的计算机模拟研究

为了了解从肽库中筛选到的TNF-α拮抗肽的作用机制,用分子模拟程序模建了4条肽序列(TBP1、2、3、6)的结构,然后利用分子对接程序建立了它们与TNF-α作用的理论模型。在得到的模型中,拮抗肽TBP2、3与TNF-α相互作用的区域位于TNF-α分子中形成三聚体的区域,提示这些肽是通过影响TNF-α三聚体的形成而发挥作用的。     

冠心病患者TNF-α水平及其基因多态性的研究

为了研究中国汉族人群中血清肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平及其-857、-863位点基因多态性与冠心病之间的相关性, 采用双抗体夹心ELISA法检测血清TNF-α水平,同时应用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)技术检测TNF-α基因多态性. 冠心病组血清TNF-α水平显著高于对照组(P<0.05),-863 位点基因多态性在两组间分布有显著差异(P<0.05),-857位点分布无差异.血清TNF-α水平显著升高提示炎性反应在冠心病病程中有重要作用,TNF-α的水平受其基因多态性的影响.     

TNF-α在宫颈息肉组织中的表达及意义

目的:检测宫颈息肉组织中肿瘤坏死因子TNF-α的表达,并探讨其在宫颈息肉发病机制中的作用.方法:对150例患者宫颈息肉组织及137例宫颈管内膜组织分别进行TNF-α免疫组织化学染色和免疫印迹检测.结果:免疫组化检查发现TNF-α主要表达在宫颈息肉组织中的浆细胞胞质内,与对照组的表达比较差异有统计学意义(t值分别为2.258,P值均＜0.05).而且免疫印迹检查发现TNF-α蛋白在宫颈息肉组织中特异性表达强度高于对照组.结论:TNF-α在宫颈息肉组织中表达增高,对其发病起着一定的作用.     

miR-124靶向TNF-α促进猪皮下脂肪细胞分化

前期研究中采用双萤光素酶报告基因验证了mi R-124与脂解因子猪TNF-α之间的靶关系,以此为基础研究mi R-124是否影响猪皮下脂肪细胞的分化。采用mi R-124模拟物mimics和抑制物inhibitor分别转染猪脂肪前体细胞并诱导其分化成成熟脂肪细胞,检测细胞的聚脂情况,甘油及甘油三酯的含量变化,荧光定量检测脂肪细胞关键转录因子PPARγ,脂肪合成和分解的主要酶FASN和HSL基因的表达变化。结果显示,过表达mi R-124能抑制TNF-α蛋白的表达,脂肪细胞脂滴多于对照组,甘油三酯(TG)含量显著增加(P0.01),甘油含量亦显著增加(P0.05),PPARγ、FASNT和HSL的表达显著上调(P0.01);抑制细胞mi R-124的表达脂滴则较少,TG含量显著减少(P0.05),PPARγ和FASN的表达均显著下调(P0.05)。mi R-124可能通过抑制TNF-α调节猪脂肪细胞的分化,为后续研究mi R-124调节脂肪代谢的相关机制奠定基础。     

小鼠急性病毒性心肌炎对TNF-α表达的影响

目的:探讨肿瘤坏死因子(TNF-α)在柯萨奇病毒B3(CVB3)感染所致的急性病毒性心肌炎中的表达。方法:用不同剂量CVB3感染小鼠建立病毒性心肌炎感染模型,测定TNF-α含量并观察心肌病变情况。结果:感染后3d开始TNF-α的表达明显升高且高剂量感染组明显高于中、低剂量感染组。结论:在CVB3感染早期TNF-α表达升高且与病毒感染量有关。     

转TNF-α基因鱼腥藻7120质粒稳定性研究

为了实现转基因鱼腥藻培养生产TMF的目的,讲究了转基因鱼腥藻的稳定性。影印法证实转TNF-α。基因鱼腥藻7120能保持质粒分配稳定性。比较无选择压力下连续传代的转丛因鱼醒藻7120在不同培养基中的生长和外源基因表达,证实没有发生质粒部分缺失,但转基因鱼腥藻在无选择压力下会降低重组质粒拷贝数。在培养过程中,种子培养越含有的新霉素可以保持生产过程质粒稳定,这可以大火减少新霉素用量。