草鱼cyclin G1基因的克隆、鉴定及适应性进化分析

本研究从草鱼(Ctenopharyngodon idellus)肝肾cDNA文库中克隆到草鱼cyclin G1基因.测序结果表明,草鱼cyclin G1全长cDNA为2 118 bp,使用ORF finder推译其开放阅读框为第256 bp～第1 155 bp,编码299个aa,SMART在线软件预测其中N端第57个aa～第143个aa为细胞周期蛋白盒.同源性比对分析显示cyclin G1在鱼类中同源性极高,其中草鱼cyclin G1与斑马鱼的同源性为90%.通过PAML软件的密码子替换模型进行适应性进化分析,结果表明cyclin G1编码蛋白的26A、171A和225K氨基酸位点受到正选择作用.本研究为进一步了解草鱼cyclin G1结构功能与分子演化打下基础.     

棉花4-香豆酸辅酶A连接酶基因克隆及原核表达

本研究从棉花中克隆了一个4CL基因,命名为Gh4CL2(GenBank登录号为FJ848870)。研究结果表明:Gh4CL2基因cDNA全长2332bp,具有一个1725bp的开放阅读框,5′非编码区为64bp,3′非编码区为543bp,编码574个氨基酸,预测分子量约为62.106kD,等电点为5.94。氨基酸同源性分析发现,Gh4CL2与来自白杨、大豆和紫草的4CL一致性较高。进一步研究Gh4CL2基因的功能,构建了该基因的原核表达载体pET-28a-4CL2,经酶切鉴定后转化到大肠杆菌BL21(DE3)中。SDS-PAGE分析表明,最佳诱导表达条件为0.5mmol/LIPTG在37℃下诱导4h,重组蛋白主要以包涵体形式出现。     

草鱼LAT2cDNA基因克隆、序列分析及组织表达检测

目的:克隆草鱼LAT2cDNA基因,分析基因生物信息及在不同组织的表达情况.方法:采用RT-PCR方法从草鱼前肠组织克隆LAT2cDNA基因,用生物软件对基因序列进行基因生物信息分析;采用RT-PCR方法检测LAT2基因在组织中的表达情况.结果:成功克隆草鱼LAT2cDNA基因,基因长1 216bp,编码404个氨基酸;与斑马鱼的同源性高达92.5%,而与哺乳类动物的同源性在75.2%～85.2%之间;对其构建的基因系统进化树与传统形态分类相吻合;预测的12跨膜结构中第1到第6个跨膜区与其它动物类似,其中完成转运功能的主要跨膜部位与其它动物同源性高达92%;并在草鱼前肠、中肠、后肠、肝、肾、心、脑、肌肉和鳃组织均检测到基因的表达.结论:为进一步探讨鱼类氨基酸吸收转运代谢及氨基酸转运载体基因表达机理奠定基础.     

AnnexinⅠ在PCOS 大鼠颗粒细胞中的表达及意义

目的:探讨膜联蛋白Ⅰ(AnnexinⅠ)在多囊卵巢综合征(PCOS)大鼠卵泡颗粒细胞的表达及生物学意义。方法:采用免疫组织化学方法及灰度值测定AnnexinⅠ在PCOS组和对照组的卵泡颗粒细胞中的表达。结果:AnnexinⅠ在两组中的各级卵泡颗粒细胞中均有表达,PCOS组AnnexinⅠ在窦状卵泡中表达显著高于对照组(P<0.05)。结论:PCOS组AnnexinⅠ在窦状卵泡颗粒细胞的表达上调,且PCOS中窦状卵泡颗粒细胞的凋亡增加,说明AnnexinⅠ参与了卵巢颗粒细胞的凋亡过程,并且发挥了重要作用。     

C3和C4植物光合途径的适应性变化和进化

高等植物大多为C₃植物, C₄植物和景天酸代谢(Crassulacean acid metabolism, CAM)植物是由C₃植物进化而来的。C₄途径的多源进化表明, 光合途径由C₃途径向C₄途径的转变相对简单。该文分析研究了植物光合途径的进化前景, 指出C₄植物是从C₃植物进化而来的高光效种类, 且地质时期以来降低的大气CO₂浓度和升高的大气温度以及干旱和盐渍化是C₄途径进化的外部动力。C₃植物的C₄途径的发现说明植物的光合途径并非是一成不变的, C₃和C₄植物的光合特征具有极大的可塑性, 某些环境的变化会引起植物光合途径在C₃和C₄途径之间转变。C₃植物具有的C₄途径是环境调控的产物, 是对逆境的适应性进化结果, 因而光合途径的转变也适用于干旱地区植被的适应性生存机理研究。该文还利用国外最新的C₄光合进化模型介绍了植物在进化C₄途径中所经历的7个重要时期(从分子基础到形态基础、结构基础, 再到物质代谢水平、光合酶活水平, 直到C₃和C₄途径协调运转时期, 最后达到形态与功能最优化阶段), 并结合全球气候变化的特点对国内外相关领域的研究进行了分析, 总结了植物光合途径的适应性转变和进化的研究成果, 为今后的相关工作提出建议。     

AnnexinⅠ蛋白在人前列腺癌中的表达及临床意义

目的：探讨AnnexinⅠ蛋白在前列腺癌组织中的表达及其与前列腺癌发生、发展、转移及预后的关系。方法：回顾性分析110例前列腺癌及40例前列腺增生组织中AnnexinⅠ蛋白的表达与前列腺癌Gleason分级、年龄、临床分期、转移及预后的相关性。结果：前列腺癌患者的AnnexinⅠ表达水平显著地低于良性前列腺增生症患者（P〈0．05）;AnnexinⅠ在低分化癌中表达较高,与高、中分化癌相比有显著性差异（P〈0．05）;而高、中分化癌之间AnnexinⅠ表达均较低,两者之间无显著性差异（P〉0．05）。前列腺癌AnnexinⅠ蛋白表达与年龄无关,而与临床分期、淋巴结转移及预后有关（P〈0．05）。结论：AnnexinⅠ蛋白表达下调与前列腺癌发生发展和预后密切相关,可作为反映前列腺癌生物学行为和判断预后的生物标记物.     

棉花Gh4CL1基因克隆及表达

根据棉花纤维特异表达cDNA文库分析得到的4-香豆酸辅酶A连接酶基因EST序列设计引物,采用RT-PCR技术从棉花中克隆了1个4CL基因,命名为Gh4CL1(GenBank登录号为FJ479707).结果表明:Gh4CL1基因cDNA全长2 331 bp,具有1个1 722 bp的开放阅读框,5′非编码区为64 bp,3′非编码区为445 bp,编码573个氨基酸,预测分子量约为61.951 kD,等电点为5.70.氨基酸同源性分析发现,Gh4CL1与来自白杨、大豆和紫草的4CL同源性较高.半定量RT-PCR检测表明,Gh4CL1基因在不同发育阶段的棉纤维中均有表达,在开花后20 d的棉纤维中表达量最大,说明该基因可能参与调控棉纤维细胞的伸长和次生壁的增厚.Gh4CL1基因在棉花花瓣中表达量最高,在其他组织中低水平表达或不表达.     

CaPKR-like在鲫鱼与草鱼组织中的表达特性分析

摘要：PKR是由干扰素诱导的最重要的抗病毒蛋白之一,能抑制细胞和病毒蛋白的合成。鲫鱼PKR基因(CaPKR-like)是鱼类第一个,也是非哺乳类脊椎动物第一个报道的PKR全长cDNA序列。本研究制备了CaPKR-like N-端包含Za结构域的多克隆抗体,采用Western blots检验PKR-like在鲫鱼和草鱼组织中的表达特性。Western blots显示在未诱导的鲫鱼和草鱼中该基因表达水平非常低,但是经Poly I:C免疫一周后,在鲫鱼和草鱼等8种组织中有较强的PKR-like蛋白产生。结果暗示：CaPKR-like与哺乳类PKR有相同的组织表达特性。。     

C3、C4和C3-C4中间型植物的进化

介绍了有关C3、C4和C3-C4中间型植物进化的形态学、生理学、分子生物学、遗传学等方面的证据;推断地球上首先出现C3植物,然后是C3-C4中间类型植物,最后出现C4植物.     

人ING4的基因克隆及真核表达

目的克隆人生长抑制因子家族（inhibitor of growth famility member4,ING4）基因,构建其真核表达载体pEGFP—ING4。方法提取人胎盘总RNA,经RT—PCR扩增出ING4 cDNA,克隆至pEGFP—C2载体,构建的真核表达载体pEGFP—ING4用双酶切、基因测序进行序列鉴定;转染MCF-7细胞用荧光显微镜和免疫组化检测重组质粒的表达。结果RT—PCR产物为750bp的条带,双酶切和基因测序正确,转染可见目的蛋白融合表达。结论从人胎盘组织中成功克隆了ING4基因并构建其真核表达质粒在人MCF-7细胞中表达,为进一步研究1NG4基因的作用及抗肿瘤机制奠定了基础。     

草鱼生肌因子5基因的克隆及其组织表达谱分析

目的:获得草鱼生肌因子5(Myf-5)基因序列,分析其在草鱼不同组织和不同发育阶段中的表达规律。方法:根据鲤鱼Myf-5基因序列设计引物,用草鱼肌肉组织总RNA,经RT-PCR扩增其Myf-5基因序列;利用半定量RT-PCR分析草鱼Myf-5基因在草鱼不同组织和不同发育阶段的mRNA表达特性。结果:获得了草鱼Myf-5基因开放读框序列723 bp,GenBank登录号为GU290227;该基因编码由240个氨基酸残基组成的蛋白,具有MyoD家族基因的典型性碱性螺旋-环-螺旋(bHLH)结构,其氨基酸序列与斑马鱼、鲤鱼、虹鳟、大西洋鲑等的同源性较高(74%~97%),与哺乳动物和禽类如人、小鼠、大鼠、猪、牛和鸡的同源性较低(56%~60%);在草鱼红肌、白肌、肝胰脏、肾脏、脑和肠中均检测到Myf-5基因的表达,红肌、白肌和脑组织中Myf-5基因mRNA的表达量显著高于其他组织(P<0.05);草鱼Myf-5基因的表达随着其生长发育呈下降趋势,在较大规格试验鱼(500 g)中的表达显著低于其他2种规格(50~60 g、120~130 g)的试验鱼(P<0.05)。结论:获得了草鱼Myf-5基因序列,其在红肌、白肌和脑组织中的表达量显著高于其他组织,并随生长发育呈下降趋势,为研究Myf-5在草鱼肌肉发育过程中的作用提供了基础资料。     

草鱼PAX7基因的克隆、序列分析及组织表达

配对盒基因7(Paired box 7 gene,PAX7)在神经嵴发育及原肠胚形成、肌肉自主更新与再生中扮演着重要角色,对细胞更新、分化、凋亡等起着十分重要的调控作用。参照Gen Bank中斑马鱼、线鳍电鳗和虹鳟等物种PAX7序列的保守区域设计简并引物,进行反转录PCR扩增,获得草鱼PAX7基因的部分序列,长645 bp,编码214个氨基酸,包含编码128个氨基酸的PAX7蛋白配对框(PD)。氨基酸序列比对结果发现,草鱼PAX7基因与其他物种具有高度的相似性,与斑马鱼、线鳍电鳗、日本青鳉、金头鲷、虹鳟、大西洋鲑、北极嘉鱼、人、野牦牛、褐家鼠和小鼠的PAX7氨基酸序列同源性可达90%-97%;各物种PAX7部分氨基酸序列的系统进化树结果显示,草鱼与斑马鱼、日本青鳉、北极嘉鱼、大西洋鲑、虹鳟、线鳍电鳗和金头鲷聚为一大支,小鼠、褐家鼠,野牦牛与人类另聚一支,所得结果符合物种传统分类进化地位。运用实时荧光定量PCR检测草鱼PAX7基因在各组织中的差异表达,结果显示PAX7基因在肌肉中表达量最高;其次是前肠和皮肤,在心、脑、肾和肝中仅少量表达,所得结果与该基因的功能相一致。     

草鱼瘦素受体基因片段序列的克隆及其组织表达分析

根据斑马鱼、大西洋鲑和人等物种巴知的瘦素受体基因核苷酸保守区序列设计一对简并引物,通过RT-PCR法从草鱼肝胰脏中首次克隆获得草鱼瘦素受体基因的片段序列.该片段序列长713 bp,编码237个氨基酸,氨基酸序列分析表明草鱼瘦素受体基因片段氨基酸序列与其他物种的相似性在35％ -86％之间.通过邻接法(Neighbor Joining,NJ)构建系统进化树显示,鱼类的瘦素受体独立聚成一支,草鱼与金鱼、斑马鱼聚成一支,再与日本青鳉、黑点青鳉、红鳍东方鲀和大西洋鲑聚成一支.通过实时荧光定量PCR分析草鱼瘦素受体基因的组织差异表达,结果表明,草鱼瘦素受体基因在肝胰脏、肌肉、脑、心脏、脾和肠系膜脂肪组织中均有表达,其中在脾脏组织中表达量最多,显著高于其他组织(P＜0.05),其次是心脏、脑、肌肉和肠系膜脂肪组织,在肝胰脏组织中表达量最低,且显著低于其他组织(P＜0.05).     

草鱼与鲢鱼肥胖基因克隆与序列分析

肥胖基因产物leptin是调节哺乳动物摄食、能量代谢等生命活动的重要细胞因子。 应用RT-PCR和RACE法获得了草鱼(Ctenopharyngodon idellus)和鲢鱼(Hypophthalmichthys molitrix) leptin基因的全长cDNA序列分别为1 096 bp和1 176 bp,编码173和172个氨基酸。氨基酸序列同源性分析表明,草鱼和鲢鱼的leptin序列与其它鲤科鱼类leptin的同源性较高,而与其他鱼类的leptin同源性很低,但所有鱼类的leptin均含有用于形成二硫键的高度保守的半胱氨酸。系统进化树分析显示,草鱼和鲢鱼leptin与其他鱼类leptin聚于一进化分支。应用PCR和Genome Walker方法,进一步获得了草鱼和鲢鱼leptin基因的内含子和5′侧翼区序列。结果表明,获得的草鱼和鲢鱼leptin基因长度分别为2 129 bp和2 192 bp,含有与其他脊椎动物leptin相似的基因结构（含三个外显子和两个内含子）。本研究为深入研究鱼类肥胖基因结构功能关系与鱼类抗肥胖品系定向遗传选育奠定了良好的基础。     

草鱼RAGs的克隆及不同发育阶段的表达分析

草鱼(Ctenopharyngodon idellus)在1、2龄阶段的抗病能力很差,但到3龄阶段后义具有了很强的抗病能力,提示草鱼的免疫系统可能要到3龄发育阶段才会完善.重组激活基因(Recombination activating genes,RAGs)编码的蛋白质专一性介导淋巴细胞抗原识别受体基因的V(D)J重组,在脊椎动物淋巴细胞正常发育成熟过程中起关键作用.为了进一步研究草鱼免疫系统建立和完善的发育遗传学因素,通过PCR方法克隆了草鱼重组激活基因rag1和rag2,分析了它们在不同发育阶段的表达.草鱼rag1基因从起始密码到终止密码总长4188 bp,由三个外显子和两个内含子组成,其开放阅读框长3192 bp,编码1063个氨基酸.草鱼rag2基因从起始密码到终止密码总长1593bp,没有内含子,编码530个氨基酸.氨基酸序列比对分析表明,预测的草鱼RAG1和RAG2蛋白的功能区域与其他脊椎动物的相应功能区具有很高的同源性.从受精后第4天开始,RT-PCR即可检测到rag1基因的表达,在随后的幼鱼阶段rag1基因维持了高水平的表达.在1龄草鱼的头肾中仍可以检测到rag1基因的表达,但在3龄草鱼头肾中没有检测到rag1基因的表达.这些结果表明草鱼从胚胎的孵化期开始到1龄幼鱼阶段是免疫球蛋白(Ig)和T细胞受体(TCR)V(D)J重组的活跃时期,在3龄发育阶段其淋巴细胞系中V(D)J重组活动已经很少,免疫系统中Ig和TCR库的多样化过程趋于完成,其免疫系统已经比较完善.     

草鱼穿孔素C端溶细胞活性分析

穿孔素的溶细胞作用是机体杀伤病毒和其他微生物感染细胞以及肿瘤细胞的一种效应机制。穿孔素在鱼类非特异性免疫中起重要作用。为了解鱼类穿孔素的功能,根据穿孔素基因序列特征,在已构建的草鱼肝肾cDNA文库中克隆了草鱼穿孔素基因C端包含1个完整蛋白激酶C保守结构域(C2)的cDNA。将该cDNA与表达载体pET32a连接并转化表达菌DE3,诱导表达。His-Bind亲和柱纯化获得了草鱼穿孔素C端表达多肽(PFP-C)。将PFP-C与兔红细胞共育,结果表明：PFP-C具有溶血功能,且在pH 7.5时活性最大,其溶血活性对Ca2+有明显的依赖性。     

草鱼过氧化氢酶全长cDNA的克隆、序列同源分析与组织表达

过氧化氢酶(catalase,CAT)是生物体内抗氧化防御系统的关键酶之一,在清除过氧化氢而避免机体产生氧化应激的过程中起重要作用.本研究从草鱼(Ctenopharyngodon idellus)肝胰脏中克隆了CAT完整编码序列(complete coding sequence,CDS).该CAT序列(GenBank登陆号:FJ560431)全长2 263 bp,包括完全开放阅读框(ORF) 1 575 bp、5'非编码区(UTR) 118 bp和3' UTR 570 bp.其ORF编码525个氨基酸残基,理论分子量为59.59 kD,等电点为7.02.在草鱼CAT cDNA的终止密码子附近,其3' UTR具有长且完整的AC重复序列,与斑马鱼、鲢鱼及啮齿类动物CAT的3' UTR AC重复序列相似.序列比较表明,草鱼CAT的核苷酸及推测氨基酸序列与其它多种物种的一致性均较高,其一致性分别为93.4%~43.0%和98.1%~63.3%.同时,草鱼CAT cDNA的推测氨基酸序列具有与其它动物高度保守的特征性基序,包括亚铁血红素结合信号序列"RLFSYPDTH"、酶活性中心序列"FDRERIPERVVHAKGA"及3个催化位点残基His74、Asn147和Tyr357.此外,草鱼CAT还具有保守的亚铁血红素结合口袋与NADPH 结合位点.根据草鱼CAT基因的上述特征,推测其属于CAT基因家族中的单功能或典型CAT基因亚群.采用实时荧光定量PCR (Q-PCR)检测草鱼CAT的组织表达特征.结果显示,草鱼CAT mRNA在所检测的11种组织器官中均有表达,其中在肝中表达水平量较高,在红肌、白肌和脂肪中表达量较低.本研究结果将有助于进一步探讨鱼类CAT基因的结构与功能,并为研究其抗氧化分子机理奠定基础.     

丙型肝炎病毒中国株非结构蛋白2~3部分基因cDNA克隆序列分析及表达

丙型肝炎病毒 (ＨｅｐａｔｉｔｉｓＣｖｉｒｕｓ,ＨＣＶ)是输血后和许多社区获得性非甲非乙肝炎的主要致病因子。ＨＣＶ为单股正链ＲＮＡ病毒 ,其基因组长约 9.5Ｋｂ ,编码区含一个大开放读码框架 ,编码 30 1 0 30 33氨基酸残基的多蛋白前体 ,经宿主蛋白酶和病毒蛋白酶加工成具有生物学功能的成熟蛋白。ＨＣＶ各区域的分布顺序是 :Ｃ Ｅ1 Ｅ2 ｐ7 ＮＳ2 ＮＳ3 ＮＳ4Ａ ＮＳ4Ｂ ＮＳ5Ａ ＮＳ5Ｂ[1] 。本文我们应用ＲＴ ＰＣＲ方法从ＨＣＶ患者血清中扩增编码病毒蛋白酶的非结构蛋白 (ＮＳ2 ＮＳ3)部分基因 ,对其核苷酸序列进行了分析 ,…     

斜带石斑鱼CD4基因克隆和组织表达分析

CD4 作为TCR的共受体可以提高TCR/抗原-MHC复合体的稳定性,辅助TCR识别抗原,并且参与T细胞活化.本研究从斜带石斑鱼Epinephelus coioides头肾中克隆得到全长2240 bp的CDM cDNA序列,该序列包含长1410 bp的ORF,编码469个氨基酸,预测蛋白分子包含一段信号肽,4个Ig样区...