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相似文献
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1.
链霉菌质粒pSGL1最小复制子序列测定及分析   总被引:1,自引:1,他引:0  
张华  洪斌  李元 《微生物学报》1999,39(4):327-332
质粒pSGL1(7.4kb)是从球孢链霉菌(Streptomycesglobisporus)中分离得到的一个高拷贝质粒,已证明其最小复制子位于Sau3AI酶切的20kb片段上。对该片段进行亚克隆,测序后数据表明该片段是一个新序列。仅有一个开放阅读框架(ORFR)位于最小复制子中,推测其编码的蛋白质含有滚环复制质粒复制酶的特定序列。  相似文献   

2.
链霉菌大肠杆菌穿梭质粒载体pSGLgpp的构建及应用   总被引:2,自引:0,他引:2  
张华  李元 《微生物学报》2000,40(6):605-609
质粒pSGL1(74kb)是从球孢链霉菌(\%Streptomyces geobisporus)\%中分离得到的一个高拷贝质粒,已测定其最小复制子序列。从球孢链霉菌总DNA中采用PCR方法扩增获得编码C1027前蛋白信号肽的DNA片断gpp。将gpp克隆至pSGL1的衍生质粒pSGLN中,获得新的链霉菌表达型质粒载体pSGLgpp。应用该质粒进行了人的河溶性白细胞介素1受体I型的表达。  相似文献   

3.
日本血吸虫26kD抗原基因在BCG中的表达   总被引:5,自引:0,他引:5  
研究了外源基因日本血吸虫26kD抗原(Sj26GST)在卡介苗(bacilusCalmete-Guerin,BCG)、耻垢分枝杆菌(M.smegmatis)和大肠杆菌(E.coli)中的表达.运用重组DNA和聚合酶链反应(PCR)等分子生物学技术,以表达Sj26GST的E.colipGEX衍生质粒为模板,经PCR得到编码Sj26GST的全长cDNA片段.将其按正确的阅读框顺序,克隆到人结核杆菌热休克蛋白(heatshockprotein,HSP)70的启动子下游,再将HSP70启动子和Sj26GST基因一起亚克隆到E.coli-分枝杆菌穿梭质粒pBCG-2000中,得到E.coli-分枝杆菌穿梭表达质粒pBCG-Sj26.pBCG-Sj26电转化入BCG和M.smegmatismc2155中表达Sj26GST抗原,所表达的天然重组Sj26GST(rSj26GST)为可溶性蛋白,在SDS-PAGE上分子量为26kD处可见明显的表达蛋白带.其表达量分别占BCG和M.smegmatis菌体总蛋白的15%和10%.可见,Sj26GST基因能在BCG中高效表达.  相似文献   

4.
刘菊萍  李元 《遗传学报》1993,20(6):481-487
以质粒pIJ486为载体,将来源于质粒pHT1的肿瘤坏死坏因子(TNF-a)cDNA克隆至变铅青链霉菌,以新霉素(30μg/ml)为选择标记,获得了数百转化子,实验表明No.7转化子s.lividans TK54-HT所含重组质粒pIJT7已克隆有TNFcDNA。L929细胞毒实验结果表明该转化子TNF表达量可达10^8活性单位/升以上,中和实验确证其表达产物为人TNF-a,SDS-PAGE表明克  相似文献   

5.
利用来自假单胞菌的GL-7-ACA酰化酶的信号肽和表达元件基因片段构建了GL-07-ACA酰化酶的分泌型高表达质粒pTrcCA1S和pKKCA1S,其中pTrcCA1S为IPTG诱导型质粒,pKKCA1S为组成型质粒。pTrcCA1S和pKKCA1S转入受体菌TG1中都可高表达GL-7-ACA酰化酶基因并将表达产物转运到周质空间,完整细胞酰楷酶比活力分别为23.9单位每克菌体和18.3单位每克菌体  相似文献   

6.
质粒pcDNA3—HGF的大规模纯经制备研究   总被引:6,自引:2,他引:6  
质粒pcDNA3-HGF具有潜在的临床治疗缺血性疾病的应用前景。大规模纯化制备是质粒DNA应用于基因治疗的关键步骤。质粒大规模纯化制备流程包括:发酵、离心收集细胞、碱性裂解、Q-Sepharose XL捕获质粒DNA、Source 15Q精制质粒DNA,所得纯超螺旋质粒pcDNA3-HGF符合质量标准。该纯化制备方法避免使用动物源性的酶及有毒试剂。  相似文献   

7.
利用合成的寡聚核苷酸片段,从质粒pOS1000中分离出具有适合克隆位点的苏云金芽孢杆菌(Bacilusthuringiensis)δ内毒素cryIA(c)全长基因。将该基因与大肠杆菌表达载体pKK2233重组,并引入大肠杆菌JM109中,经IPTG诱导,获得了超量表达的CryIA(c)蛋白。将cryIA(c)全长基因插入链霉菌表达载体pHZ1272中,得到重组质粒pHZ1256,将该质粒引入变铅青链霉菌(Streptomyceslividans)JT46中,经硫链丝菌素诱导,通过Westernbloting测定表明,重组变铅青链霉菌JT46(pHZ1256)已表达出相应的CryIA(c)蛋白。杀虫试验表明,大肠杆菌和链霉菌所表达出的δ内毒素CryIA(c)对小菜蛾均有毒杀作用,其致死率分别为93%和57%。  相似文献   

8.
EB病毒潜伏膜蛋白(LMP)是由病毒编码的主要的与病毒致宿主细胞潜伏感染有关的蛋白之一。我们用基因重组技术,把含有LMP基因(BNLF1)3个外显子(exon)开放阅读框架(ORF)的长1.80kbp的DNA片段,和能分解HygromycinB的含有SV40早期启动子和HgryomycinB磷酸转移酶全基因(长1025bp)的DNA片段(长1.60bp),同时重组于亚克隆载体pBluescriptSK(pBS)中,并使该重组质粒pBS-LMP-Hyg(长5767bp)在乳地鼠肾传代细胞(BHK)中获得表达。BHK细胞在经此重组质粒转染后,LMP阳性细胞是2%,在HygromycinB的持续压力下,LMP表达细胞率可达20%。3个月后,LMP表达细胞逐渐减少。5个月后,不能测到LMP表达细胞。经免疫荧光和蛋白印迹(Westemblot)实验证实,人鼻咽癌、风湿性关节炎和正常人血清中不含有抗LMP抗体。  相似文献   

9.
分别从重组质粒pUB1及其M(13)亚克隆S1中将7号淀粉酶链霉菌(StreptomycesdiastaticusNo.7)M1033(以下简称S.di.M1033)木糖异构酶基因的-192-+581bp片段克隆入链霉菌启动子探测质粒pIJ4083中,转化变铅青链霉菌(S.lividans)TK24。通过对其邻苯二酚加双氧酶活性的检测表明,该片段具有启动子活性。应用M13亚克隆S1和合成引物P6延伸制备放射性标记的单链DNA探针;通过S.di.M1033的总RNA的S1核酸酶保护实验,确定了其转录的起始位点,并由此探讨了与木糖异构酶基因表达有关的一些因素。  相似文献   

10.
通过有机试剂抽提,CF-11纤维素柱层析,从感染水稻齿叶矮缩病毒菲律宾分离株(RiceRaggedStuntVirus,Philippineisolate,简称RRSV-P)的水稻植株中获取该病毒的全基因组,即获得从Segment1到Segment10(S1-S10)的10条双链RNA(dsRNA),然后设计合适的引物,用RT-PCR方法得到S9的cDNA并将其克隆到pUC119质粒上扩增,以双链测序法测定该cDNA的全序列。同时又将此cDNA克隆到大肠杆菌表达质粒pGEX-3X上,在大肠杆菌菌株DE3中用IPTG诱导表达,经超声波破菌、离心、Glutathione-sepharose4B亲和层析,得到纯化的分子量为64kD的融合蛋白。  相似文献   

11.
用电泳迁移分析方法研究了21nt脱氧寡核苷酸G3TG2TGT2G5TG2TGT(CP1)与129bp的乙肝病毒(HBV)核衣壳启动子(Cp)片段内一位点结合形成的三链DNA的特异性及稳定性.在克隆有HBV基因组的质粒pCP10的酶切产物中,CP1仅与含Cp的129bp片段结合.在20mmol/LMg2+溶液中其解离常数(Kd)为1.4×10-7mol/L.不同离子稳定三链DNA的效果依次为sp4+(精胺)>Mg2+>Zn2+>Na+>K+,离子之间存在相互竞争作用.比CP1多一误配碱基的脱氧寡核苷酸G2TG2TGTG3TG2TG2TG2T(CP2)在20mmol/LMg2+溶液中与Cp结合的Kd值约为CP1的1/7,而在60mmol/LK+或5mmol/LZn2+溶液中检测不到它与Cp的结合,这进一步显示了三链DNA形成的特异性.细胞的生理离子浓度被认为是:Sp4+1mmol/L,Mg2+10mmol/L,K+140mmol/L,因此,CP1在细胞内将能特异地与Cp结合并具有较好的稳定性.  相似文献   

12.
通过有机试剂抽提,CF-11纤维素柱层析,从感染水稻齿叶矮缩病毒菲律宾分离株(RRSV-P)的水稻植株中获取该病毒的全基因组,即获得从Segment 1到Segment 10(S1-S10)的10条双链RNA(dsRNA),然后设计合适的引物,用RT-PCR方法得到S9的cDNA并将其克隆到pUC119质粒上扩增,以双链测序法测定该cDNA的全序列。同时又将此cDNA克隆到大肠杆菌表达质粒pGEX  相似文献   

13.
本文报道以人Epstein-Barr病毒的潜伏膜蛋白基因BNLF-1作为目标基因,插入至逆转录病毒载体pZipNeoSV(x)的克隆位点上,由此获得重组逆转录病毒载体pZipNeoSV(x)-LMP及其反义载体pZipNeoSV(x)-anti-LMP,通过质粒DNA的电转染和G418培养基筛选,然后对10个抗性克隆进行基因整合分析,获得6个含MLV-LTR/BNLF-1融合基因的阳性克隆,采用Northern杂交及Western印迹证明,在克隆细胞中表达了2.6kb的mRNA片段及相应的蛋白质分子,这是由BNLF-1基因的EDL1启动子表达的产物。  相似文献   

14.
用BamHI和HindII将丙肝病毒C+E1DNA片段从其克隆载体pGEM3zf-HCV/C+E1上切下,经Taq酶补齐3’末端后插入到载体pSVL-T中,构建成丙肝病毒C+E1真核表达载体pSVL-HCV/C+E1。本实验中重组效率达64.7%(11/17),正向插入为50%(2/4)。  相似文献   

15.
从葡萄糖异构酶产生菌──玫瑰红链霉菌336中分离得到质粒pSR336。经电泳检测和电镜观察证实,存在共价闭合超螺旋和开环两种分子构型,分子量约为6.35kb,拷贝数约为130。采用高温(40℃),吖啶橙、溴化乙锭和SDS等物理、化学因素消除pSR336,均未获得质粒消除株,表明pSR336质粒是非常稳定的。用变铅青链霉菌TK21作受体,进行平皿杂交以检测pSR336的接合转移能力,未观察到麻点(pock)的形成。用HindⅢ分别酶切pSR336和pIJ486,连接得到一个嵌合质粒pIR30,检测玫瑰红链霉  相似文献   

16.
鸡肌球蛋白轻链激酶表达载体的构建   总被引:3,自引:0,他引:3  
鸡肌球蛋白轻链激酶(MLCK)在调节平滑肌细胞收缩中具有重要作用。用PCR产生构建所需的限制性内切酶Sal I位点,将鸡MLCK cDNA插入质粒pBKrsv中,构建成pBKrsv-MLCK,并通过酶切图谱、SalI位点序列分析得到证实。重组质粒在大肠杆菌中获得表达。  相似文献   

17.
用PCR 方法从芝田硫化叶菌中扩增了编码一种新酶,即麦芽寡糖基海藻糖合酶( MTSase) 的基因,扩增的2-2kb DNA 插入到原核表达载体pBV220 中,构建成重组质粒pSBGT1 。pSBGT1 中MTSase 基因在大肠杆菌中得到表达。SDSPAGE 分析表达产物MTSase蛋白的分子量约为74kDa ,同核苷酸序列测定所推导的值相符。表达产物占细胞总蛋白约4-4 % 。pSBGT1 产生的重组酶作用于淀粉部分水解物,使DE 值降低,得到非还原糖或低还原糖。  相似文献   

18.
重组质粒DNA用于基因治疗需要大量符合药学规格的质粒DNA,发酵是影响质粒产率的关键步骤之一。比较了4种不同的培养基对pcDNA3-HGF产率的影响,其中自配复合培养基(ZP)质粒产率最高,而LB培养基的质粒产率最低,5L发酵罐发酵最终pcDNA3-HGF产率达72mg/L,为大规模发酵生产提供依据。  相似文献   

19.
人铜锌超氧化物歧化酶基因的克隆和乳酸乳球菌中的表达   总被引:5,自引:0,他引:5  
采用RT-PCR技术从人肝总RNA中分离扩增了0.45kb的人铜锌超氧化物歧化酶(Cu/ZnSOD)基因的cDNA序列,首先克隆至大肠杆菌表达质粒pET23b,进行了序列测定和超高表达,将Cu/Zn,SODcDNA亚克隆至乳酸乳球菌表达载体pMG36e,用电穿孔法将重组质粒pMG36esod转化到乳酸乳球菌,获得Cu/Zn SOD的组成型表达,其表达量约占乳酸乳球菌可溶性蛋白的5%以上,活性染色表  相似文献   

20.
从 He La 细胞中提取总 R N A,采用反转录 P C R 技术,从该总 R N A 中扩增了约 530 bp 的sh T N F R55 基因的 c D N A,并克隆至质粒 p U C m el中酪蛋白酶 m el Cl 分泌信号肽编码序列的下游,构建成含融合基因 m el/ T N F R 的重组质粒 p U C m el/ T N F R.把融合基因 m el/ T N F R 插入链霉菌表达质粒 p I J459 的多克隆位点,使之位于 erm 强启动子的下游,得到重组表达质粒 p I J459 m el/s T N F R.经 Southern 杂交证明重组质粒 p I J459 m el/s T N F R 插入了 s T N F R55 基因片段.对重组菌株 Streptom yces lividans(p I J459 m el/s T N F R)的发酵液进行 S D S P A G E、受体配基杂交( Ligand blot)分析、对 T N F 敏感的 L929 细胞的细胞毒性中和试验表明,可溶性肿瘤坏死因子受体 s T N F R55 在链霉菌中得到了分泌表达,表达产物具有生物学活性.表达产物的分子量约在 26~28 k D 之间.  相似文献   

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