Txnip基因siRNA慢病毒表达质粒构建及促进猪前体脂肪细胞分化

硫氧还蛋白互作蛋白(thioredoxin interacting protein, Txnip)是一种氧化还原调节蛋白质,与硫氧还蛋白结合并抑制其活性,调节细胞氧化还原状态,影响细胞多种生理过程,然而其在猪脂肪细胞分化中的作用尚不明确。本文设计合成3对靶向猪Txnip基因的shRNA寡核苷酸,分别连接于重组慢病毒载体pGLV_3/H_1/GFP+Puro构建siRNA表达质粒。测序验证后,与包装质粒共转染293T细胞,获得滴度1×10~8 pfu/mL的慢病毒干扰质粒。以MOI值100转染原代培养猪前体脂肪细胞,转染率均达80%以上,其中Txnip-shRNA-2转染细胞Txnip基因沉默率达75%。转染Txnip-shRNA-2的猪前体脂肪细胞用成脂分化培养液诱导后,每隔1 d检测细胞成脂分化及相关基因表达。结果发现,其分化比阴性对照质粒转染或未转染细胞显著增强(P<0.05),PPARγ和FAS mRNA表达水平显著提高(P<0.05)。本文构建siRNA慢病毒表达质粒能有效干扰猪Txnip基因表达,Txnip表达沉默可通过上调PPARγ表达促进猪前体脂肪细胞分化。本研究提示,Txnip可能是猪脂肪细胞分化的抑制因子。     

慢病毒载体介导的脂肪细胞SOCS-3RNA干扰及对瘦素反应的研究

体内存在瘦素抵抗是大多数肥胖者的共同特征,但如何缓解瘦素抵抗目前还无有效方法.通过应用慢病毒载体介导的RNA干扰技术对大鼠脂肪细胞中瘦素信号转导通路的负反馈抑制因子—细胞因子信号转导抑制因子-3(suppressor of cytokine signaling 3,SOCS-3)基因进行敲减,观察其对大鼠重组瘦素作用的反应.研究发现,阴性对照慢病毒和SOCS-3shRNA慢病毒对成熟脂肪细胞的感染率约为80%.利用real-time PCR和Westernblot法检测发现SOCS-3 shRNA慢病毒通过在成熟脂肪细胞内表达shRNA而造成SOCS-3基因在mRNA和蛋白水平的敲减,有效率分别为72%和57%;经50nmol/L瘦素处理6h后,感染阴性对照病毒的脂肪细胞SOCS-3mRNA表达有明显升高(P0.05),而感染SOCS-3 shRNA慢病毒的脂肪细胞SOCS-3mRNA表达则无明显变化(P0.05).结果表明,利用SOCS-3shRNA慢病毒去敲减脂肪细胞中SOCS-3的表达可能对于解除肥胖者外周瘦素抵抗具有一定的作用.     

PGC-1β和SREBP-1c在猪脂肪细胞分化过程中的相互作用

为研究过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活因子1β(PGC-1β)与SREBP-1c在猪前体脂肪细胞分化过程中的表达规律及其相互作用,分析二者功能上的联系,采用Western 印迹及细胞免疫荧光技术检测PGC-1β与SREBP-1c在猪脂肪细胞分化过程中的表达,shRNA干扰和免疫共沉淀技术分别探讨了PGC-1β对SREBP-1c的调节作用及2种蛋白质在体内的结合活性.结果显示,PGC-1β与SREBP-1c 蛋白的表达均随猪脂肪细胞分化逐渐增加,且在分化细胞的核和胞浆中均有分布. 干扰PGC-1β显著下调了SREBP-1c和脂肪细胞分化标记基因C/EBPα的表达(P<0.05),同时降低了细胞内甘油三酯的积累.免疫共沉淀证明,PGC-1β与SREBP-1c蛋白在猪脂肪细胞分化过程中存在结合作用. 以上结果表明,PGC-1β能够促进猪脂肪细胞分化并对SREBP-1c有调节和结合作用,推测二者的结合可能与其对脂肪细胞的分化调节机制相关,将对PGC-1β调控脂肪细胞分化的功能和机理研究提供新途径.     

BAMBI通过促进ERK1/2磷酸化抑制猪前体脂肪细胞分化

为了研究BAMBI在猪前体脂肪细胞分化过程中的作用,构建了BAMBI慢病毒干扰载体,包装并感染猪前体脂肪细胞,采用油红O染色、油红O提取比色法检测猪前体脂肪细胞分化情况,采用Real-time qPCR、Western blotting检测成脂标志基因mRNA以及蛋白水平表达的变化情况。结果表明,BAMBI慢病毒干扰载体感染前体脂肪细胞后显著降低了BAMBI的表达,shRNA2干扰效率最高,达到了60%以上,干扰BAMBI后能增加猪脂肪细胞的脂质积累,增加了成脂标志基因过氧化物酶体增殖物激活受体γ(Peroxisome proliferator-activated receptorγ,PPARγ)和脂肪酸结合蛋白2(Adipocyte protein 2,ap2)的表达。此外,干扰BAMBI后ERK1/2的磷酸化水平减少了。这些结果表明,BAMBI可能通过促进ERK1/2的磷酸化抑制脂肪细胞分化。     

慢病毒介导RNA干扰SOCS3基因在猪前体脂肪细胞和成肌细胞中的表达

构建细胞信号抑制因子3(suppressor of cytokine signaling 3,SOCS3)慢病毒干扰载体,获得有感染性的病毒颗粒,感染猪前体脂肪细胞和成肌细胞,并检测其对前体脂肪细胞的干扰效率.首先设计并合成3对针对目的基因SOCS3的siRNA序列,退火后连接于LentiH1上,测序验证后,与包装质粒△8.9和vsv-g共转染到293T细胞中进行包装和浓缩,纯化后测定病毒滴度,然后感染猪前体脂肪细胞和成肌细胞.重组慢病毒载体LentiH1-siRNA经酶切和测序鉴定正确,病毒滴度为3×107tu/mL,感染猪成肌细胞和前体脂肪细胞后,可见报告基因GFP的表达;RT-PCR和Western印迹分析表明,前体脂肪细胞中SOCS3的表达被显著下调,其中LentiH1-siRNA3介导对SOCS3基因mRNA和蛋白的干扰效率分别达53%和71%.本研究成功构建了猪SOCS3慢病毒干扰载体,感染猪前体脂肪细胞能稳定沉默SOCS3基因的表达,为深入研究SOCS3的功能奠定了基础.     

猪IL-18 在杆状病毒/昆虫细胞中的表达

IL-18作为一种多效性细胞因子,在机体免疫应答及各种生理功能中发挥着重要的调节作用,根据猪IL-18基因序列设计1对引物,将编码猪IL-18的成熟蛋白基因亚克隆到杆状病毒转移载体pFastBacDual中,并在C端融合6个组氨酸标签以利于纯化,然后转化到含穿梭载体Bacmid的感受态细胞DH10Bac中,发生转座作用。将重组质粒转染昆虫细胞,SDS-PAGE可检测到分子量为18 kDa左右的重组蛋白,Western blotting证实该重组蛋白可与兔抗猪IL-18抗体发生特异性反应。纯化后蛋白能明显促进猪T淋巴细胞转化,表明所表达的IL-18具有较高的生物活性。此研究为进一步开发研制新型免疫佐剂奠定了基础。     

慢病毒载体介导的RNA干扰Akt2表达抑制猪前体脂肪细胞分化

丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶2(serine/threonine protein kinase2,Akt 2)是胰岛素信 号通路的关键基因, 与细胞生存和癌症的发生密切相关. 但Akt2在前体脂肪细胞分化中 的作用仍然不是十分清楚. 本研究构建了慢病毒干扰载体pLentiH1-Akt2-shRNA 1, 2, 3及scrambled, 经酶切和测序鉴定均正确; 这4种干扰载体分别转染HEK293T细胞后, 均 获得有感染性的病毒颗粒并感染猪前体脂肪细胞. 转染HEK293T细胞48 h 后real-time PCR分析和转染72 h 后Western 印迹分析表明, Akt2-shRNA2 和shRNA3 介导的Akt2 mRNA和蛋白表达被显著下调 (P <0.05), 其中pLentiH1-Akt2-shRNA3 介导的对Akt2 mRNA和蛋白的干扰效率均达到70%以上 (P <0.01). 进一步研究发现, 猪前体脂肪细胞 中Akt2被有效干扰后, 细胞中脂滴明显减少并变小, 且成脂标志基因PPARγ和aP2蛋白 水平被显著下调. 本研究结果表明, Akt2 knockdown可显著抑制猪前体脂肪细胞分化.     

白细胞介素6重组逆转录病毒载体的构建及鉴定

目的 构建特异性过表达大鼠IL-6基因的重组逆转录病毒载体,并在大鼠嗜铬细胞瘤PC12细胞和人胚肾HEK293细胞中检测IL-6的表达。方法以大鼠骨髓间充质干细胞mRNA为模板,经PCR获得目的基因IL-6,将其定向克隆到逆转录病毒载体pSEB-3H中,构建重组逆转录病毒质粒pSEB—IL-6,经脂质体分别转染到PC12细胞和HEK293细胞中,应用Real—timePCR和ELISA的方法在mRNA和蛋白质水平检测IL-6的表达变化。继而用HEK293细胞中包装获得的含有pSEB—IL-6的病毒颗粒进一步感染PC12细胞,Real—timePCR检测,IL-6mRNA的表达水平变化。结果PCR电泳及酶切鉴定证实目的基因正确克隆至逆转录病毒载体中,其基因序列与Genbank报道一致;Real—timePCR和ELISA结果均显示,逆转录病毒质粒pSEB—IL-6转染PC12细胞和HEK293细胞后,IL-6的表达水平较对照组显著上调;经pSEB—IL-6逆转录病毒颗粒感染的PC12细胞中,IL-6mRNA表达水平较对照组提高4倍。结论成功构建了特异性表达大鼠儿-6基因的重组逆转录病毒载体pSEB—IL-6,并获得了具有感染能力的逆转录病毒颗粒,感染真核细胞后可高表达IL-6,为进一步研究IL-6的功能及其在多种疾病中的免疫调节机制提供重要的分子手段。     

EGFL7 基因RNAi慢病毒表达载体的构建及鉴定

目的：构建人类表皮生长因子域7（EGFL7）基因RNA干扰（RNAi）重组慢病毒表达载体。方法：参照小分子干扰RNA 的设 计原则,应用OligoDesigner 3.0 软件设计三条靶向人EGFL7 基因的RNA干扰序列（hEGFL7-RNAi）,并将其分别插入含有绿色 荧光蛋白（GFP）的慢病毒载体pLV3 中,获得重组质粒,与包装质粒pRsv-REV、pMDlg-pRRE 和pMD2G共同转染293T细胞,包 装产生重组慢病毒,培养72 h后,应用qRT-PCR 检测慢病毒感染人脐静脉内皮细胞（HUVEC）后靶基因mRNA 的水平,以评价 其基因沉默效果。结果：筛选出3 条人EGFL7 基因的RNAi 序列,分别包装出重组慢病毒,其滴度分别为1× 108、2× 108和5× 108TU/mL,将其转染入HUVEC 后,EGFL7mRNA表达均受到明显抑制(P<0.05)。结论：成功筛选出三条针对人EGFL7基因的 RNAi有效靶序列,并成功构建重组慢病毒表达载体,证明该序列可沉默HUVECs 中EGFL7 基因的表达。     

融合蛋白pIL6-IL2在E.coli中的表达及活性鉴定

白细胞介素 2 (interleukin 2 ,IL-2 )与白细胞介素 6(interleukin 6,IL-6)能分别刺激T淋巴细胞增殖与B淋巴细胞分泌免疫球蛋白 ,从而促进动物机体的细胞免疫与体液免疫 ;另外IL2与IL6在发挥生物学活性时还有相互协同作用。因此 ,将去除信号肽的猪白细胞介素 6(pIL-6)与猪白细胞介素 2 (pIL-2 )cDNAs序列通过一段Linker相连 ,克隆到E .coli表达载体pPET-2 8a中。该融合蛋白IL6-IL2在E .coli表达菌BL2 1 (DE3)中获得成功表达 ,SDS-PAGE分析分子量约为40kDa ,表达量达到总菌体的 66.26%。用IL6依赖的B9细胞与IL2依赖的CTLL细胞增殖试验进行融合蛋白IL6 IL2的生物活性检测 ,其活性可分别达到 0.8× 10³U /mg和 6.4× 10³ U/mg。     

Rosiglitazone regulates IL-6-stimulated lipolysis in porcine adipocytes

Interleukin (IL)-6, a proinflammatory cytokine, stimulates adipocyte lipolysis and induces insulin resistance in obese and diabetic subjects. However, the effects of the anti-diabetic drug rosiglitazone on IL-6-stimulated lipolysis and the underlying molecular mechanism are largely unknown. In this study, we demonstrated that rosiglitazone suppressed IL-6-stimulated lipolysis in differentiated porcine adipocytes by inactivation of extracellular signal-related kinase (ERK). Meanwhile, rosiglitazone enhanced the lipolysis response of adipocytes to isoprenaline. In addition, rosiglitazone significantly reversed IL-6-induced down-regulation of several genes such as perilipin A, peroxisome proliferators activated receptor gamma (PPARγ), and fatty acid synthetase, as well as the up-regulation of IL-6 mRNA. However, mRNA expression of PPARγ coactivator-1 alpha (PCG-1α) was enhanced by rosiglitazone in IL-6-stimulated adipocytes. These results indicate that rosiglitazone suppresses IL-6-stimulated lipolysis in porcine adipocytes through multiple molecular mechanisms.     

人IL-6 /sIL-6R 结合分子模型的建立及在药物筛选中的应用

目的：建立人IL-6 /sIL-6R 结合的分子模型,用于筛选IL-6 /sIL-6R的抑制剂。方法：将人IL-6基因克隆至原核表达载体pET28a（+）中表达IL-6蛋白,western blot及人IL-6检测试剂盒分析鉴定表达蛋白。同法将人sIL-6R在pET15b载体中表达,纯化并用western blot检测目的蛋白。依据ELISA原理建立IL-6 /sIL-6R 结合的分子模型,并通过改变IL-6、sIL-6R及IL-6 antibody的浓度来优化该模型,用于IL-6 /sIL-6R拮抗药物的筛选。结果：人IL-6可在载体PET28a（+）中高效表达,且经western blot鉴定正确,人IL-6检测试剂盒检测显示具有较高的免疫活性。sIL-6R在PET15b中表达,western blot鉴定正确。通过对IL-6 /sIL-6R结合的分子模型的优化,得到其最佳条件为：IL-6R 1?g/well, IL-6 500ng/well, IL-6 antibody 1?g/well。应用该模型筛选发现有些化合物可显著抑制IL-6与其受体的结合。结论：成功构建IL-6 /sIL-6R结合的分子模型,为高通量筛选IL-6拮抗剂提供平台。     

人IL-6受体胞外区真核表达载体的构建及体外表达

目的构建人IL-6受体（IL-6R）胞外区真核表达载体,检测其在体外培养细胞中的表达。方法利用PCR扩增IL-6R胞外区,克隆到pcDNA3．1（＋）中,用双酶切、测序鉴定。重组质粒通过脂质体转染HL-60细胞,用G418进行筛选,利用Western印迹检测IL-6R蛋白表达。结果PCR扩增出1218bp的目的片段,双酶切和测序结果显示重组质粒正确。Western印迹结果显示转染细胞能够表达目的蛋白。结论成功构建了人IL-6R胞外区真核表达载体,并且能够在真核细胞中表达。     

Effects of RXRα gene silencing on the porcine adipocyte differentiation in vitro

The elucidation of the molecular mechanism of porcine adipocyte differentiation is important not only to domestic animal industry, but also to medical science because of the similarities in the trait of body lipid deposition between human and pigs. In this study, we investigated the roles of RXRα in porcine (Sus scrofa) adipocyte differentiation by using RNAi method and primary cultured porcine adipocytes. With the transfection of RXRα-siRNA, the gene and protein expressions of RXRα were successfully inhibited in differentiating porcine adipocytes. By the RXRα gene silencing, the adipocyte differentiation, as characterized by lipid accumulation and GPDH activity, was suppressed. Furthermore, in association with the decrease in RXRα gene expression level, PPARγ and C/EBPα genes expression level also decreased, suggesting that RXRα is involved in their expression. Thus, our study clearly demonstrated the pivotal roles of RXRα in porcine adipocyte differentiation.     

马齿苋多糖对溃疡性结肠炎大鼠肠组织IL-6/STAT3及NF-κB的影响

目的：采用TNBS （2,4,6-三硝基苯磺酸）复制溃疡性结肠炎大鼠模型,探索马齿苋多糖对溃疡性结肠炎大鼠肠组织IL6/STAT3及NF-κB的影响,明确IL-6/STAT3信号通路与慢性炎症性肠病发病的关系,为慢性溃疡性结肠炎的治疗寻找新靶点。方法：将40只SD大鼠随机分为对照组、模型组、美沙拉嗪组和马齿苋组（n=10）。采用TNBS诱导复制结肠炎模型,造模成功后第3天开始灌胃给药：美沙拉嗪组剂量为每次10 mg/kg,每日1次,连续3周;马齿苋组给予马齿苋多糖,每次10 ml/kg,每日1次,连续3周;模型组和对照组大鼠给予等体积生理盐水灌胃,每日1次,连续3周。收集大鼠结肠内容物称重,干燥后再次称重,取结肠组织作病理切片。采用ELISA试剂盒检测血清IL-6、IL-1β、TNF-α和核转录因子-kappa B （NF-κB）含量;免疫组化染色法测定结肠髓过氧化物酶（MPO）;RT-PCR法检测信号转导和转录激活因子（STAT3）、IL-6的mRNA。结果：与模型组、美沙拉嗪组比较,马齿苋组大鼠排便状态明显改善,肠粘膜水肿减轻;血清IL-6、sIL-6Rα、gp130,肠组织MPO、NF-κB含量均降低（P<0.01）。与模型组比较,马齿苋组STAT3、IL-6mRNA的表达水平明显降低（P<0.01）。与对照组比较,上述指标无显著性差异（P>0.05）。结论：马齿苋多糖通过降低大鼠血清IL-6、sIL-6Rα、gp130含量及肠组织MPO、NF-κB水平,减轻sIL-6Rα与IL-6形成复合物所致的炎症反应;经IL-6/STAT3信号通路下调大鼠肠组织STAT3和IL-6的mRNA水平,从而抑制炎症的发生。     

猪白细胞介素4,6融合基因和CpG基序对猪蓝耳病疫苗免疫的强化效应

为探索新型高效安全的猪蓝耳病疫苗免疫佐剂,本实验用离子交联法制备壳聚糖纳米颗粒包裹猪融合基因PIL-46和CpG基序的真核表达质粒(CNP-(VRIL-46 VR1C)),将CNP-(VRIL-46 VR1C)肌注接种过猪蓝耳病灭活苗的长白川白杂交猪,接种后1、2、4、6和8周采取实验猪静脉血,用Sandwich ELISA检测血清中白细胞介素2(IL-2)、IL-4、IL-6和IgG、IgA、IgM及特异抗体的含量,同时检测外周血液免疫细胞数量的变化。结果发现实验猪接种CNP-(VRIL-46 VR1C)后1～8周内,其血清中IL-2、IL-4、IL-6和IgG、IgA、IgM及特异抗体的含量较对照组均显著增多(P<0.05),淋巴细胞和单核细胞数量也明显升高(P<0.05)。这些表明接种CNP-(VRIL-46 VR1C)的实验猪的特异体液和细胞免疫水平均显著多于对照组,提示PIL-46基因和CpG基序组合能显著增强猪的特异体液和细胞免疫机能,明显提高其免疫防御力,具有研制为高效安全的分子免疫增强剂的应用前景。     

蒲公英多糖对溃疡性结肠炎大鼠IL-6/STAT3信号通路的影响

目的：观察蒲公英多糖对溃疡性结肠炎大鼠模型IL-6/STAT3信号通路的调控作用。方法：清洁级SD大鼠40只,雌雄各半,随机分为4组（n=10）：空白组、模型组、阳性对照组、蒲公英多糖组。采用2,4,6-三硝基苯磺酸（TNBS）诱导结肠炎大鼠模型,阳性对照组采用美沙拉嗪10 mg/kg·d灌胃,蒲公英多糖组采用蒲公英多糖10 mg/kg·d灌胃,治疗4周后处死,观察大鼠结肠粘膜病理改变,检测大鼠血清白介素-6（IL-6）含量、结肠髓过氧化物酶（MPO）、白介素-6受体（sIL-6Rα）、糖蛋白130（gp130）、转录活化因子3（STAT3）、IL-6 mRNA表达。结果：与正常组比较,模型组大鼠血清IL-6含量明显升高（P<0.01）,MPO阳性密度明显增高（P<0.01）,sIL-6Rα、gp130含量明显增高（P<0.01）,肠组织STAT3、IL-6 mRNA相对表达量明显增高（P<0.01）;与模型组比较蒲公英多糖组、美沙拉嗪组大鼠血清IL-6含量明显降低（P<0.01）,MPO阳性密度明显降低（P<0.01）,sIL-6Rα、gp130含量明显降低（P<0.01）,肠组织STAT3、IL-6 mRNA相对表达量与模型组比较明显降低（P<0.05）。结论：蒲公英多糖能够降低溃疡性结肠炎大鼠IL-6水平,下调IL-6/STAT3通路中sIL-6Rα、gp130蛋白表达量,进而下调大鼠肠组织STAT3、IL-6 mRNA的转录水平,缓解结肠组织的炎症状态,保护和修复粘膜组织,起到治疗溃疡性结肠炎的作用。     

TGF-β is necessary for induction of IL-23R and Th17 differentiation by IL-6 and IL-23

TGF-β and IL-6 induce Th17 differentiation, and IL-23 is required for expansion and maintenance of Th17 cells. Recently, it was shown that IL-6 up-regulates IL-23R mRNA in naive CD4⁺ T cells and therefore IL-6 and IL-23 synergistically promote Th17 differentiation. However, the molecular mechanism whereby IL-6 and IL-23 induce Th17 differentiation and the relevance to TGF-β remain unknown. Here, we found that IL-6 up-regulated IL-23R mRNA expression, and IL-6 and IL-23 synergistically augmented its protein expression. The combination induced Th17 differentiation, and TGF-β1 further enhanced it. IL-6 augmented endogenous TGF-β1 mRNA expression, whereas the amount of TGF-β produced was not enough to induce Th17 differentiation by IL-6 alone. However, unexpectedly, the up-regulation of IL-23R and induction of Th17 differentiation by IL-6 and IL-23 were almost completely inhibited by anti-TGF-β. These results suggest that the induction of IL-23R and Th17 differentiation by IL-6 and IL-23 is mediated through endogenously produced TGF-β.     

Chronic interleukin-6 (IL-6) treatment increased IL-6 secretion and induced insulin resistance in adipocyte: prevention by rosiglitazone

IL-6 has emerged as an important cytokine upregulated in states of insulin resistance such as type 2 diabetes. We evaluated the chronic effect of IL-6 on insulin signaling in 3T3-F442A and 3T3-L1 adipocytes. First, cells responded to a chronic treatment with IL-6 by initiating an autoactivation process that increased IL-6 secretion. Second, IL-6-treated adipocytes showed a decreased protein expression of IR-beta subunit and IRS-1 but also an inhibition of the insulin-induced activation of IR-beta, Akt/PKB, and ERK1/2. Moreover, IL-6 suppressed the insulin-induced lipogenesis and glucose transport consistent with a diminished expression of GLUT4. IL-6-treated adipocytes failed to maintain their adipocyte phenotype as shown by the downregulation of the adipogenic markers FAS, GAPDH, aP2, PPAR-gamma, and C/EBP-alpha. IL-6 also induced the expression of SOCS-3, a potential inhibitor of insulin signaling. Finally, the effects of IL-6 could be prevented by rosiglitazone, an insulin-sensitizing agent. Thus, IL-6 may play an important role in the set-up of insulin resistance in adipose cell.