不同氮水平下冬小麦叶绿体中甘油醛-3-磷酸脱氢酶活性的变化

NADP-甘油醛-3-磷酸脱氢酶(E.C.1.2.1.13,缩写为G-3-PDH)是卡尔文环中催化光合最初产物3-磷酸甘油酸(3-PGA)还原成3-磷酸甘油醛的关键调节酶,反应如下:     

叶绿体中依赖NAD(P)H的甘油醛-3-磷酸脱氢酶活性的测定

甘油醛-3-磷酸脱氢酶(以下简称GAP脱氢酶)是叶绿体卡尔文环中的一种重要的调节酶,它是卡尔文环中唯一利用由光系统Ⅰ产生的还原能力(NADPH),催化光合作用的最初产物3-磷酸甘油酸(3-PGA)还原成3-磷酸甘油醛,反应如下:     

龙虾肌羧甲基甘油醛-3-磷酸脱氢酶NAD~+荧光衍生物的生成与性质

龙虾肌甘油醛-3-磷酸脱氢酶与兔肌酶一样,用碘代乙酸修饰后,在NAD~+存在下经紫外光照射也能形成荧光衍生物。 pH对荧光衍生物的生成和稳定性有很大影响,同时,异类离子的不同影响也很明显。 定磷分析法测定荧光衍生物上的NAD~+含量,同位素示踪法观察衍生物生成过程的脱羧,都证明此光化学反应为半位反应。     

NADP~ 在兔肌甘油醛3-磷酸脱氢酶中作为氢受体的活力

兔肌甘油醛-3-磷酸脱氢酶以NADP~ 作氢受体时,有极轻微的活力,实验表明它不是由于所用NADP~ 试剂中含有NAD~ 或酶制剂中含有磷酸酯酶、转氢酶等造成的干扰。采用高浓度酶对纯化后的NADP~ 测定结果是:NADP~ 作为氢受体的活力仅及NAD~ 的二百分之一。米氏常数K_m为700μm。NADP~ 对NAD~ 的还原无明显抑制作用。不同来源的甘油醛-3-磷酸脱氢酶对辅酶专一性程度有差别,酵母酶的专一性较兔肌酶为高:NADP~ 作为氢受体的活力仅为NAD~ 的千分之一。     

NADP~ 在兔肌甘油醛3-磷酸脱氢酶中作为氢受体的活力

兔肌甘油醛-3-磷酸脱氢酶以NADP~ 作氢受体时,有极轻微的活力,实验表明它不是由于所用NADP~ 试剂中含有NAD~ 或酶制剂中含有磷酸酯酶、转氢酶等造成的干扰。采用高浓度酶对纯化后的NADP~ 测定结果是:NADP~ 作为氢受体的活力仅及NAD~ 的二百分之一。米氏常数K_m为700μm。NADP~ 对NAD~ 的还原无明显抑制作用。不同来源的甘油醛-3-磷酸脱氢酶对辅酶专一性程度有差别,酵母酶的专一性较兔肌酶为高:NADP~ 作为氢受体的活力仅为NAD~ 的千分之一。     

对硝基苯氨甲酰甲基溴对甘油醛-3-磷酸脱氢酶的抑制

甘油醛-3-磷酸:NAD氧还酶(甘油醛-3-磷酸脱氢酶,酶学委员会编号1.2.1.12)是一个典型需要巯基的酶。许多巯基试剂如碘代乙酸或对氯汞苯甲酸等皆能完全抑制酶的活力。近年来一些作者曾利用标记的碘代乙酸研究了酶和抑制剂的结合当量。我们发现对硝基苯氨甲酰甲基溴(以下简     

水稻叶绿体中GAP脱氢酶、FBP酶和醛缩酶的比较研究

光合作用同化二氧化碳的碳素循环(即卡尔文环)所生成的糖磷酯,主要从环中的两个反应步骤向环外转移,这两个酶促反应是由甘油醛-3-磷酸脱氢酶(简称GAP脱氢酶)和果糖-1,6-双磷酸酯酶(简称FBP酶)催化的,即在固定二氧化碳后,由FBP酶、GAP脱氢酶和醛缩酶的作用,将卡尔文环的产物     

甘油醛-3-磷酸脱氢酶的变性和失活动力学研究

用紫外差吸收和萤光方法对甘油醛-3-磷酸脱氢酶及其衍生物的SDS变性动力学研究结果表明,不论对于全酶、酶朊、羧甲基化酶,还是光照酶,在酶浓度为5μM,SDS的浓度为6.24mM,25℃恒温条件下,测量差吸收ΔA_(295)随时间的变化,或在λ_(ex)=305nm,λ_(em)=335nm测萤光强度随时间的变化,其结果均表现为由三个简单一级反应组成的复合一级反应,三个速度常数,对于上述四种酶来说尽管各不相同,但它们的数量级分别为:k_1=1秒~(-1),k_2=10~(-2)秒~(-1),k_3=10~(-3)秒~(-1)。这表明甘油醛-3-磷酸脱氢酶每个亚基中的三个色氨酸由于所处的空间位置的不同,在空间结构发生变化时,分别以不同的速度由酶蛋白分子内部的非极性环境暴露于其外部的极性环境。另外还发现,在这四种酶中,全酶的变性速度最小,而羧甲基化酶的变性速度最大。这说明酶经羧甲基化后空间结构的稳定性减弱,因而更易于为SDS变性。与此同时,我们测定了全酶和酶朊的SDS失活过程,并同它们的变性过程进行了比较。从酶的失活过程类似于变性过程也是由三个一级反应组成的复合一级反应这一事实来看,全酶和酶朊的失活过程似有部分变性并具有部分活力的中间物存在。     

甘油醛-3-磷酸脱氢酶的变性和失活动力学研究

用紫外差吸收和萤光方法对甘油醛-3-磷酸脱氢酶及其衍生物的SDS变性动力学研究结果表明,不论对于全酶、酶朊、羧甲基化酶,还是光照酶,在酶浓度为5μM,SDS的浓度为6.24mM,25℃恒温条件下,测量差吸收ΔA_(295)随时间的变化,或在λ_(ex)=305nm,λ_(em)=335nm测萤光强度随时间的变化,其结果均表现为由三个简单一级反应组成的复合一级反应,三个速度常数,对于上述四种酶来说尽管各不相同,但它们的数量级分别为:k_1=1秒~(-1),k_2=10~(-2)秒~(-1),k_3=10~(-3)秒~(-1)。这表明甘油醛-3-磷酸脱氢酶每个亚基中的三个色氨酸由于所处的空间位置的不同,在空间结构发生变化时,分别以不同的速度由酶蛋白分子内部的非极性环境暴露于其外部的极性环境。另外还发现,在这四种酶中,全酶的变性速度最小,而羧甲基化酶的变性速度最大。这说明酶经羧甲基化后空间结构的稳定性减弱,因而更易于为SDS变性。与此同时,我们测定了全酶和酶朊的SDS失活过程,并同它们的变性过程进行了比较。从酶的失活过程类似于变性过程也是由三个一级反应组成的复合一级反应这一事实来看,全酶和酶朊的失活过程似有部分变性并具有部分活力的中间物存在。     

甾体微生物转化反应关键酶3-甾酮-Δ1-脱氢酶的研究进展

3-甾酮-Δ~1-脱氢酶是甾体化合物微生物代谢的关键酶,负责催化3-酮基类甾体化合物A环上的C1,2位脱氢反应。其不仅在甾体母核的早期降解途径中发挥重要作用,而且能通过A环C1,2位上双键的导入显著提高甾体化合物的生理活性。本文详细阐述了3-甾酮-Δ~1-脱氢酶在微生物中的种属分布和序列特征、酶的生物学特性、生理作用、催化机理以及分子改造等,为深入研究该酶在甾体生物转化领域中的应用提供重要参考。     

小麦叶绿体中甘油醛-3-磷酸脱氢酶、果糖-1,6-双磷酸酯酶和醛缩酶的比较研究

现已证明光合作用同化CO_2的循环(卡尔文环)生成的糖磷酯可向环外运输,以致在叶绿体内形成淀粉和在细胞质中合成蔗糖、脂肪酸,并提供能量。而卡尔文环光合产物的输出与环中的甘油醛-3-磷酸脱氢酶     

分光光度法与^14C标记法测定RuBP羧化酶的活性的比较

方法的原理分光光度酶偶联法是根据RuBP羧化酶催化RuBP产生的磷酸甘油酸与NADH的氧化作用相偶联的原理设计的。当加入ATP及NADH后,NADH在PGK和GAPDH的催化下氧化为NAD~ ,每羧化1molRuBP有2molNADH被氧化,根据在波长340nm处光密度的变化,可测知NADH     

基于己糖激酶与葡萄糖-6-磷酸脱氢酶共表达的辅酶NADPH高效再生

【目的】构建己糖激酶与葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的大肠杆菌共表达体系,以葡萄糖为底物实现辅酶NADPH的高效再生。【方法】通过分子生物学方法,克隆己糖激酶HKgs、HKpp基因,并于Escherichia coli BL21(DE3)中表达,再将己糖激酶HKgs、HKpp分别与葡萄糖-6-磷酸脱氢酶Gpd PP共表达,实现NADPH的原位再生。比较两个共表达工程菌的辅酶再生效果,并针对催化活力较高的工程菌BL21(HKgs+Gpd PP)进行表达条件优化。【结果】NADPH再生活力达到856 U/L。该辅酶再生体系与醇脱氢酶Adh R联合催化,使不对称还原4-氯乙酰乙酸乙酯的催化活力提高至原始值的2.5倍。【结论】通过己糖激酶与葡萄糖-6-磷酸脱氢酶在大肠杆菌中的共表达,构建了一个新的NADPH高效再生体系,并用于醇脱氢酶催化的不对称还原反应。     

同步辐射在D-甘油醛-3-磷酸脱氢酶及其系列衍生物高分辨率衍射数据收集中的应用

用气相扩散法培养出 P.Versicolor龙虾肌HOLO-D-甘油醛-3-磷酸脱氢酶(HOLO一GAPDH)、149位巯基羧甲基化的衍生物(CM—GAPDH)和紫外光激发生成的新NAD荧光衍生物(IRR—GAPDH)的晶体.用同步辐射强x光光源一磷光贮屏一Weissenberg照相机系统,选择a+b或a-b晶轴为旋转轴;收集了酶及其衍生物1.8A分辨率的三套衍射数据;用WEIS程序进行了数据处理.三套数据的Rmerge分别为4.93%、6.22%和5.77%.用CAD程序对三套数据进行了比较分析.     

同步辐射在D-甘油醛-3-磷酸脱氢酶及其系列衍生物高分辨率衍射数据收集中的应用

用气相扩散法培养出 P.Versicolor龙虾肌HOLO-D-甘油醛-3-磷酸脱氢酶(HOLO一GAPDH)、149位巯基羧甲基化的衍生物(CM—GAPDH)和紫外光激发生成的新NAD荧光衍生物(IRR—GAPDH)的晶体.用同步辐射强x光光源一磷光贮屏一Weissenberg照相机系统,选择a+b或a-b晶轴为旋转轴;收集了酶及其衍生物1.8A分辨率的三套衍射数据;用WEIS程序进行了数据处理.三套数据的Rmerge分别为4.93%、6.22%和5.77%.用CAD程序对三套数据进行了比较分析.     

高等植物葡萄糖-6- 磷酸脱氢酶与6- 磷酸葡萄糖酸脱氢酶基因的不同进化起源

葡萄糖-6-磷酸脱氢酶与6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶是植物戊糖磷酸途径中的两个关键酶。在克隆了水稻质体葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因OsG6PDH2和质体6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因Os6PGDH2基础上,分析比较了水稻胞质和质体葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因和6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶基因的基因结构、表达特性和进化地位。结合双子叶模式植物拟南芥两种酶基因的分析结果,认为高等植物葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因和6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶基因在进化方式上截然不同,葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的胞质基因与动物和真菌等真核生物具有共同的祖先;6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶的胞质酶和质体酶基因都起源于原核生物的内共生。讨论了植物葡萄糖-6-磷酸脱氢酶与6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶基因可能的进化模式,为高等植物及质体的进化起源提供了新的资料。     

高等植物葡萄糖-6-磷酸脱氢酶与6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶基因的不同进化起源

葡萄糖-6-磷酸脱氢酶与6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶是植物戊糖磷酸途径中的两个酶.在克隆了水稻质体葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因OsG6PDH2和质体6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因Os6PGDH2基础上,分析比较了水稻胞质和质体葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因和6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶基因的基因结构、表达特性和进化地位.结合双子叶模式植物拟南芥两种酶基因的分析结果,认为高等植物葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因和6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶基因在进化方式上截然不同,葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的胞质基因与动物和真菌等真核生物具有共同的祖先;6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶的胞质酶和质体酶基因都起源于原核生物的内共生.讨论了植物葡萄糖-6-磷酸脱氢酶与6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶基因可能的进化模式,为高等植物及质体的进化起源提供了新的资料.     

龙虾肌甘油醛-3-磷酸脱氢酶及其衍生物与NAD~+的结合

平衡柱层析法测得每分子龙虾肌羧甲基化甘油醛-3磷酸脱氢酶能结合3.9分子NAD~+,而每分子光照酶则只能结合2分子NAD~+。 由蛋白荧光淬灭法得到,在25℃、pH7.0的磷酸盐缓冲液中,全酶、羧甲基酶及光照酶与NAD~+结合时均呈负协同性。     

基于多酶级联协调表达策略高效催化合成 (S)-2-羟基丁酸

2-羟基丁酸 (2-hydroxybutyric acid,2-HBA) 是合成生物可降解材料和各种药物的重要中间体,化学法合成的外消旋2-HBA需要去消旋才能获得光学纯对映异构体,应用于工业。文中通过在大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3) 中共表达苏氨酸脱氨酶 (Threonine deaminase,TD)、l-乳酸脱氢酶 (l-lactate dehydrogenase,LDH)和甲酸脱氢酶 (Formate dehydrogenase,FDH),构建 (S)-2-HBA的合成途径及其辅因子NADH的循环系统,实现了基于三酶级联反应催化底物l-苏氨酸合成 (S)-2-HBA。为了解决多酶级联催化反应中中间产物2-酮丁酸的生成速率和消耗率不匹配的问题,文中通过启动子工程策略来调控TD和FDH的表达水平,获得了多酶催化速率平衡的重组大肠杆菌P21285FDH-T7V7827。在5 L发酵罐水平,全细胞催化反应16 h,(S)-2-HBA的最高产量为143 g/L,摩尔转化率为97%,为迄今报道的最高产量的1.83倍,使其具有较强的工业化应用潜力。此外,结果表明,在单细胞中构建可调节的多酶协调表达系统对生物催化制备羟基酸类化合物具有重要意义。     

迟缓爱德华氏菌中甘油醛-3-磷酸脱氢酶的胞外分泌调控

【目的】迟缓爱德华氏菌甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)是糖酵解途径中关键酶之一,前期研究证实是一种广谱性抗原,可作为水产养殖细菌病免疫防治中疫苗的开发靶点。本文探究迟缓爱德华氏菌甘油醛-3-磷酸脱氢酶的胞外分泌机制。【方法】通过Western blot和ELISA方法考察迟缓爱德华氏菌经典分泌系统缺失株GAPDH胞外分泌情况;使用ELISA方法对迟缓爱德华氏菌突变体文库的GAPDH胞外分泌进行了大规模筛查,并结合q RT-PCR对筛查得到的插入失活株进行了表达分析。【结果】经典分泌系统与GAPDH的胞外分泌存在一定相关性。突变体文库的大规模筛查得到两株GAPDH分泌量明显增加的插入失活株Δesr A和Δesr C,这两个基因的失活会导致GAPDH的胞外分泌量显著上调。【结论】迟缓爱德华氏菌GAPDH的胞外分泌受Esr A和Esr C负调控。