中国林蛙皮cDNA文库的构建

目的：为研究林蛙皮抗菌肽,筛选、克隆及表达相关抗菌功能基因,构建林蛙皮cDNA文库。方法：提取林蛙皮总RNA后,利用V—gene纯化试剂盒纯化mRNA,RT-PCR合成双链cDNA;取10ng／μLcDNA按照不同比例连接到入噬菌体载体,以选择最佳连接比例。结果：获得克隆总数为1．2×10^5的林蛙皮cDNA文库,重组率为99．4％。结论：所建立的cDNA文库可用于进一步筛选、克隆抗菌功能新基因。     

人尿道(阴茎)鳞癌上皮细胞(HUS-98)cDNA文库的构建及鉴定

为了进一步分离人尿道(阴茎)鳞癌组织特异性表达基因和鳞癌特异性相关基因,采用SMART技术,构建了人尿道 (阴茎)鳞癌上皮细胞cDNA文库,从人尿道(阴茎)鳞癌上皮细胞中分离总RNA并纯化mRNA,利用经修饰的oligo(dT)引物 合成cDNA第一链,利用SMART核苷酸作为cDNA第一链在mRNA5′端延伸出去的模板,采用LD-PCR合成双链cDNA,双链 cDNA经酶切和过柱分级分离后,克隆入λTriplEx2载体后经体外包装而成cDNA文库。结果表明原始人尿道(阴茎)鳞癌上 皮cDNA文库获得1.57×107个重组子,重组率达到98%。文库扩增后,滴度达到4.0×109pfu/ml,插入cDNA平均长度为2.5kb。 构建的人尿道(阴茎)鳞癌上皮cDNA文库具有良好的质量,该cDNA文库为进一步筛选鳞癌抑癌基因及鳞癌特异性表达基因 奠定了基础。     

盐碱地星星草根cDNA文库的构建及初步分析

以盐碱地原位取材的星星草根为材料,利用SMART技术构建了cDNA文库。扩增后文库的滴度为1.747×109CFU/mL,插入片段分布在0.5-2 kb之间,重组率为92%。文库ESTs序列的初步分析表明,从盐碱地星星草根的cDNA文库中筛选到耐盐相关基因S-腺苷甲硫氨酸合成酶2基因和钙牵蛋白基因的EST片段。该文库可用于进一步从中筛选星星草耐盐基因。盐碱地星星草根cDNA文库的构建为揭示星星草耐盐分子机制、挖掘星星草耐盐基因、培养耐盐植物奠定了重要基础。     

鼻咽癌组织cDNA文库的构建及抗原基因的筛选

构建人鼻咽癌组织cDNA文库,以SEREX方法从cDNA文库中筛选鼻咽癌抗原基因。采用确诊鼻咽癌患者新鲜活检癌组织构建cDNA文库,测定原始文库滴度,进行蓝白筛选以确定文库的重组率。以建库组织来源患者的自身血清,采用“一对一” 的血清学方法筛选所构建的cDNA文库,阳性克隆经PCR检测鉴定后进行序列分析。经测定原始文库滴度为7.28×10⁶pfu/mL,含3.64×10⁶个重组子,重组率为94%,扩增文库滴度为3.8×10⁹pfu/mL,cDNA插入片段大小在0.5～3.0kb之间。文库经三轮血清学筛选共获得23个阳性克隆,分别代表了16个独立的cDNA插入片段（抗原基因）。其中10个与已知基因高度同源,另外6个基因与GenBank中已知基因的部分同源,其中有3个是新基因。利用SMART技术构建了高质量的人鼻咽癌组织cDNA表达文库,有利于以cDNA文库为基础的进一步的实验研究。应用SEREX技术初步筛选鼻咽癌组织cDNA文库,共得到16个鼻咽癌相关抗原基因,其中有3个是新基因,可能为鼻咽癌的免疫学研究提供新的研究分子。     

枸杞果实cDNA文库的构建

目的 :通过构建枸杞果实cDNA文库 ,分离类胡萝卜素合成酶基因。方法 :枸杞果实RNA的提取采用改进的异硫氰酸胍 -酚 -氯仿法 ,利用PolyATractmRNAIsolationSystem(Promega公司 )分离mRNA ,然后利用UniversalRibocloneRcDNASynthesisSys tem(Promega公司 )合成双链cDNA ,在cDNA末端连接上EcoRⅠ接头 ,并与λExCell载体连接 ,利用PackageneLambdaDNAPackagingSystem进行包装。结果 :首次构建出滴度为 8 4× 10 4 pfu ml,重组效率为 86 9%的枸杞果实cDNA文库。结论 :构建出枸杞果实cDNA文库 ,为类胡萝卜素合成酶基因的分离奠定了基础     

SMART技术构建栀子cDNA文库

目的:构建栀子叶片cDNA文库。方法:提取栀子叶片总RNA。利用SMART技术合成双链cDNA。双链cDNA经限制酶Sfil酶切后与pDNR-LIB质粒连接。利用电刺激转化法将重组质粒导入E.coli DH5α而获得文库。利用PCR法检测文库的重组率。结果:原始文库滴度为2.63×105cfu/ml。随机检测文库中的15个克隆,表明重组率约为86.7%。选择14个插入片段的长度在400bp以上的克隆进行测序和生物信息学分析,结果预测的全长基因占所检测序列的64.3%。结论:成功构建了栀子叶片的cDNA文库,为栀子基因的结构和功能的研究提供了基础。     

破色期番茄果实均一化cDNA沉默文库的构建和功能基因筛选模型的初步建立

番茄果实的成熟是由多基因精细调控的一个过程．利用破色期番茄果实,根据复性动力学原理在mRNA水平进行均一化操作使高丰度和低丰度的mRNA丰度接近．然后把均一化之后mRNA反转录得到cDNA,再与基因沉默载体pTRV重组,最后把构建好的载体通过电转化的方法转入到GV3101农杆菌中,从而建立起破色期番茄果实均一化cDNA沉默文库．通过番茄果实中病毒诱导基因沉默技术,对cDNA沉默文库进行初步筛选,从而确定功能基因筛选模型．在模型建立阶段,以番茄红素合成途径相关的PDS基因作为内标基因,在100个混合农杆菌样中,成功筛选到了PDS基因．     

水稻穗发育相关基因酵母双杂交cDNA文库的构建

利用cDNA文库筛选与已知功能蛋白质互作蛋白质,是研究蛋白质之间相互作用的重要途径之一。本试验利用水稻武运粳7号(95-22)穗为材料,构建了一个穗发育相关基因酵母双杂交cDNA文库,试验表明,本实验构建的cDNA初级文库容量和目的文库容量分别为1.44×107 CFU/mL和9.6×106 CFU/mL,重组率均为95%;初级文库插入片段长度介于500～2 000 bp之间,目的文库插入片段长度介于1 000～2 000 bp之间,两者平均插入片段长度均在1 000 bp以上;通过NCBI数据库、RicexPro数据库和Rice Genome Annotiation Project数据库对目的文库中的19个单克隆测序分析得知,19个克隆测序序列匹配17个相应的基因,文库重复率为10.5%,其中16个基因均在穗部有表达。以上试验表明,本实验构建的cDNA文库是一个质量较高的文库,可以直接用于穗发育相关基因筛选。     

莱芜猪肝脏组织全长cDNA文库的构建和鉴定

目的:构建莱芜猪肝脏组织全长cDNA文库,以便研究与莱芜猪优良性状相关的基因。方法:采用改良的异硫氰酸酸胍一步法制备总RNA;利用SMART技术,以PrimeScript反转录酶逆转录合成第一链cDNA,通过LD-PCR扩增获得cDNA双链;经蛋白酶K消化和CHROMA SPIN-400柱分级分离后,收集500 bp以上的cDNA片段,并与pMD18-T载体连接,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,建成原始文库;随机挑取单菌落,用HindⅢ和EcoRⅠ进行双酶切鉴定重组子插入片段大小。结果:经鉴定,原始文库的滴度为2.8×105 cfu/mL,重组率约为98%,插入片段大小为0.5～2 kb,平均插入片段长度大于1 kb。结论:建立的cDNA文库质量良好,可以用于目的基因的筛选。     

米曲霉(Aspergillus oryzae) RIB40全长cDNA文库的构建

【目的】构建米曲霉RIB40的全长cDNA表达文库,为米曲霉功能基因的开发以及次生代谢产物合成途径相关基因的筛选与克隆奠定基础。【方法】采用RNAiso法从米曲霉RIB40菌体中提取总RNA。选用PolyATract mRNA Isolation System Ⅲ试剂盒分离纯化mRNA。以5μg mRNA为模板,按照ZAP-cDNA Synthesis Kit试剂盒说明书要求合成单、双链cDNA,使用CHROMA SPIN-400柱离心层析纯化后连接于Uni-ZAP XR表达载体上,体外包装后转染Escherichia coli XL1-Blue宿主菌。【结果】构建了米曲霉RIB40的全长cDNA文库,初级文库滴度约为2.96×106 CFU/mL,重组率约为97.8%,插入片段平均长度大于1.5 kb,达到一个高质量cDNA文库的要求。文库扩增后,滴度达到3.4×1010 CFU/mL。【结论】米曲霉RIB40全长cDNA表达文库的成功构建,将会对米曲霉基础生物学研究及相关基因的筛选与克隆奠定基础。     

正常人体淋巴细胞cDNA文库的构建

应用GIBCOBRL建库试剂盒建立了正常人体淋巴细胞cDNA文库。取新鲜的正常人外周血,分离出淋巴细胞,进行体外培养,提取总RNA,纯化mRNA,并将其反转录成cDNA,与SalI和NotI接头连接后插入λZipLox载体,体外包装后转染到Y1090宿主菌中,进行滴度测试及文库扩增。构建的正常人淋巴细胞cDNA文库含2-6×106重组子,克隆效率为5×1012重组子/g cDNA,插入片段长度约为1~5kb。扩增后的文库浓度为3×107重组子/μl,将文库稀释到10-6时所产生的噬菌斑密度最为适宜。试验结果表明,该库符合标准,所构建的正常人淋巴细胞cDNA文库为进一步筛选目的基因、制作基因芯片等提供了有效的工具。 Abstract:A lymphocyte cDNA library of normal human was constructed in order to obtain specific gene and prepare lymphocyte gene chips to detect the relative genes between psychiatric diseases and immunity.The lymphocyte was abstracted from fresh normal human blood and cultured in vitro.Total RNA of lymphocyte was extracted from the cultured cells and then mRNA was extracted further.Moreover,single-strand cDNA and double-strand cDNA were synthesized in turn.The double-strand cDNAs were ligated to SalI and NotI adaptor,which were later ligated to arms of λZipLox.Ligated-cDNAs were packed in vitro,and then infected E.coli Y1090.Titering the phage and amplifying the library.The lymphocyte cDNA library consisted of 2-6×106 recombinants with the length of 1~5kb and the cloning efficiency was 5×1012 recombinants/g cDNA.The amplified library was 3×107recombinants/μl in concentration and the number of bacteriophage plagues was the most suitable in density after it was diluted to 10-6 in concentration.The constructed cDNA library of normal human lymphocyte would be helpful to further detecting target genes and preparing gene chips etc.     

淫羊藿花蕾cDNA文库的构建与鉴定

基于sm art技术构建了淫羊藿花蕾cDNA文库并检测了其质量。结果表明,该文库重组率为95%,平均插入片段大小为1095 bp,文库滴度为2×106pfu/mL,是一个高质量的淫羊藿花蕾cDNA文库。此文库的建立将有助于克隆与次生代谢相关的基因,特别是淫羊藿黄酮特异合成代谢的基因,其次是克隆与花发育相关的基因。     

Synthesis of human fibroblast interferon by E. coli

A cDNA library was constructed using mRNA from human fibroblasts induced with poly(I):poly(C). A bacterial clone containing fibroblast interferon cDNA sequences was identified by hybridization to a cDNA probe synthesized using deoxyoligonucleotide primers which hybridize to fibroblast interferon mRNA specifically. Expression plasmids were constructed which permitted the synthesis in E. coli of 8 x 10(7) units of human fibroblast interferon per liter of culture. The bacterially produced fibroblast interferon is indistinguishable from authentic human fibroblast interferon by several criteria.     

家蝇cDNA文库的构建

自Ｂｏｍａｎ小组 (Ｓｔｅｉｎｅｒ ,1981)从惜古比天蚕(Ｈｙａｌｏｐｈｏｒａｃｅｃｒｏｐｉａ)中分离、纯化出第一种抗菌肽天蚕素以来 ,人们已在昆虫和其他无脊椎动物中发现了 170多种抗菌肽 (Ｌｏｗｅｎｂｅｒｇｅｒｅｔａｌ ,1999)。目前 ,人们不仅搞清楚了多数抗菌肽的氨基酸序列、结构和功能特点 ,而且还对一些抗菌肽的基因进行了克隆 (陈留存和王金星 ,1999)。我们以家蝇为材料 ,分离、纯化出了抗菌肽 ,在此基础上 ,构建了经过诱导的家蝇ｃＤＮＡ文库 ,以克隆其基因。1　材料和方法1 1　实验材料家蝇 (Ｍｕｓｃａｄｏｍｅｓｔｉｃａ)…     

人肺腺癌细胞系cDNA文库的建立

本文以Uni-ZAP XR为载体,成功地建立了人肺腺癌高、低转移细胞系的cDNA文库。文中同时也探讨了总RNA的提取和mRNA的分离,cDNA的第一条链及第二条链的合成及克隆到载体等在建立cDNA文库过程中,几个关键性的问题。该项工作的完成,为下一步在这两株细胞系cDNA之间进行消减式杂交,筛选转移相关基因奠定了坚实基础。