四氢嘧啶羟化酶的研究进展

作为相容性物质,5-羟化四氢嘧啶不仅可以调节渗透压,还可以稳定蛋白结构,在医药、生物制造和化工行业具有广阔的发展前景。四氢嘧啶羟化酶属于Fe2+与2-酮戊二酸依赖型双加氧酶超家族,主要催化四氢嘧啶生成5-羟化四氢嘧啶。我们简要介绍了四氢嘧啶羟化酶的基因来源、活性检测、蛋白结构、催化机理及活性中心等方面的研究进展。     

一株可用于四氢嘧啶制备的中度嗜盐菌

<正>四氢嘧啶(1,4,5,6-四氢-2-甲基-4-嘧啶羧酸)是中度嗜盐细菌的一种渗透压补偿性溶质[1],可以平衡细胞的渗透压,并且在高温、冷冻和干燥等逆境下,对酶、DNA、细胞膜和整个细胞提供保护作用,因此四氢嘧     

四氢嘧啶羟化酶的克隆表达、酶学性质及其在羟基四氢嘧啶合成中的研究

四氢嘧啶羟化酶(EctD)是双加氧酶超家族的重要成员,其底物四氢嘧啶和产物羟基四氢嘧啶的应用广泛,因此EctD在生物制造领域具有重要的应用价值。从来源于新疆盐湖的需盐色盐杆菌(Chromohalobacter salexigens)中获得四氢嘧啶羟化酶基因(ectD),并在E.coli BL21(DE3)中进行表达,对异源表达的EctD酶学性质进行研究。结果表明：EctD的最适温度是30℃、最适pH是7.5,在30℃、pH 6.5～8.0条件下具有较好的稳定性;Fe²⁺、Ba²⁺、Mn²⁺、Mg²⁺、Fe³⁺和Ca²⁺离子可增强EctD的酶活,而Co²⁺、Zn²⁺和Cu²⁺离子明显抑制EctD的酶活;动力学参数为K_m=7.63 mmol/L、k_cat/K_m =1.01 1 L/(mmol·s)、V_max ...     

四氢嘧啶微生物合成与应用研究进展

极端环境微生物定义了生命的边界.为了适应各种极端环境,极端环境微生物通过合成许多独特的活性化合物来保护自己.四氢嘧啶就是其中一种代表性的保护性物质.它最早是从极端嗜盐菌中发现的,作为调节细胞渗透压的一类相容性溶质,可以帮助微生物适应高盐等恶劣环境.研究发现四氢嘧啶不仅是一种重要的渗透压调节剂,还是一种高效的生物保护剂,...     

产氢菌的复合诱变选育及突变株HCM-23的产氢特性

以厌氧产氢细菌Clostridium sp. H-61为原始菌株, 先后经亚硝基胍(NTG)、紫外(UV)诱变, 选育得到1株高产突变株HCM-23。在葡萄糖浓度为10 g/L的条件下, 其产氢量为3024 mL/L, 比原始菌株提高了69.89%; 其最大产氢速率为33.19 mmol H2/g DW·h, 比原始菌株(19.74 mmol H2/g DW·h)提高了68.14%。经过多次传代试验, 稳定性良好。其发酵末端产物以乙醇和乙酸为主, 属于典型乙醇型发酵代谢类型。其最适产氢初始pH为6.5, 最适生长温度为36℃, 以蔗糖为最佳碳源。与原始菌株相比, 突变株HCM-23的产氢特性发生了改变, 如生长延滞期延长, 可利用无机氮源等。     

假坚强芽孢杆菌四氢嘧啶羟化酶的晶体制备及X-射线衍射研究

摘要:【目的】假坚强芽孢杆菌四氢嘧啶羟化酶蛋白纯化、晶体制备及X-射线衍射研究。【方法】通过PCR从假坚强芽孢杆菌OF4中克隆获得四氢嘧啶羟化酶基因,构建原核表达载体,经过原核表达,采用Ni-NTA亲和层析法和分子排阻色谱法纯化蛋白,289 K下采用座滴法进行晶体筛选和制备,在低温100 K下通过X-射线衍射仪(Rigaku MicroMax-007 HF)收集晶体衍射数据。【结果】通过原核表达及纯化成功获得了适合晶体生长的蛋白BpEctD。通过筛选最终在蛋白浓度为6.5 mg/mL及含有0.2 mol/L MgCl2·6H2O,0.1 mol/L Bis-Tris pH6.5,25% (W/V) 聚乙二醇3,350的缓冲液中获得了理想的蛋白晶体,其大小约为360 μm×240μm×60 μm,并在100K下成功收集了衍射数据,晶体衍射分辨率为2.40,空间群为三斜晶系P1,晶胞参数为a=45.18,b=58.87,c=68.81,α=77.48°,β=86.03°,γ=66.97°,每个不对称单位中含有2 个BpEctD单体,马修斯系数为2.44 3/Da,溶剂含量约为49.53%。【结论】衍射数据的成功收集为假坚强芽孢杆菌OF4四氢嘧啶羟化酶三维结构的解析奠定了前期基础,将有助于阐明四氢嘧啶羟化酶的催化机制。     

浑球红假单胞菌及其谷氨酸合成酶突变株氢酶活性和合成

浑球红假单胞菌野生型菌株的氢酶表达被有机碳、氮底物所抑制。在光照和黑暗时,氧浓度变化对氢酶的作用不同,但高氧浓度都阻遏氢酶的表达。微量Ni~(2+)能专一性地促进氢酶活性,固氮酶的产氢也可以调节氢酶的表达水平。该野生菌株的GOGAT突变株缺乏固氮酶和氢酶活性,在加入谷氨酰胺合成酶抑制剂MSX后,固氮酶和氢酶以相关联的方式合成出来,固氮酶产生的氢看来诱导了氢酶的合成。然而在固氮酶不表达的情况下,外源氢也可诱导氢酶的合成。     

弗氏2a志贺氏菌2457T株yciD基因缺失突变株的构建

目的:构建弗氏2a志贺氏菌2457T株yciD基因缺失突变体,以研究yciD基因的功能。方法:根据弗氏2a志贺氏菌2457T株基因组全序列,采用Red重组系统对yciD基因进行缺失,并经PCR和SDS-PAGE证实;对野生株和突变株的生长状态及生化反应进行比较研究。结果:构建了弗氏2a志贺氏菌2457T株的yciD基因缺失突变株2457TΔyciD,该突变株外膜蛋白样品中缺失了一条相对分子质量与从yciD基因推导的蛋白相当(约22000)的蛋白带。该突变株比野生株生长快,利用葡萄糖和甘露醇的能力也比野生株大为增强。结论:获得了弗氏2a志贺氏菌2457T株的yciD基因缺失突变株。     

Halomonas venusta DSM4743渗透压冲击下四氢嘧啶合成与释放

选择耐受较高NaCl浓度,而且四氢嘧啶胞内浓度阈值较高的菌株,研究其四氢嘧啶发酵条件和工艺,对于提高四氢嘧啶的制备效率具有实际意义。考察了碳源、NaCl浓度、酵母膏添加量对Halomonas venustaDSM4743四氢嘧啶合成的影响,考察了优化条件下的四氢嘧啶分批发酵进程,并利用"细菌挤奶"工艺制备四氢嘧啶。结果表明:谷氨酸单钠为唯一碳氮源、NaCl浓度为1.5mol/L、酵母膏添加量为0.5%的条件有利于四氢嘧啶合成。在优化条件下10L发酵罐分批发酵,四氢嘧啶最大合成量为3.2g/L,合成效率为2.7g/(L.d)。通过"细菌挤奶"工艺制备四氢嘧啶,6个渗透压冲击循环后,四氢嘧啶总合成量为14.7g/L,总释放量为14.3g/L,平均释放率为97%,合成效率2.1g/(L.d)。中度嗜盐菌Halomonas venusta DSM4743耐受较高浓度的NaCl,而且四氢嘧啶胞内浓度阈值较高,优化的发酵条件及"细菌挤奶"工艺,获得了较高的四氢嘧啶制备效率。     

高盐盐湖可分离嗜盐耐盐菌的种群多样性及四氢嘧啶产量评价

为了解柴达木盆地茶卡盐湖、柯柯盐湖和小柴旦盐湖等三大硫酸镁亚型高盐盐湖可分离嗜盐耐盐菌的种群多样性,采用RM中、高盐培养基筛选分离可培养的嗜盐菌和耐盐菌,扩增16S rRNA基因序列进行种属鉴定和环境因子典范对应分析(CCA),选取优势菌属构建系统发育树,并采用高效液相色谱法(HPLC)检测次级代谢产物四氢嘧啶(Ect...     

Efficient production of ectoine using ectoine-excreting strain

Halophilic bacteria strain Halomonas salina DSM 5928 was found to excrete ectoine, suggesting its potential in the development of a new method of ectoine production. We performed HPLC and LC–MS analyses that showed that Halomonas salina DSM 5928 excreted ectoine under constant extracellular osmolarity. Medium adopting monosodium glutamate as a sole source of carbon and nitrogen was beneficial for ectoine synthesis. The total concentration of ectoine was not affected by NaCl concentration in the range 0.5–2 mol l⁻¹. The total concentration of ectoine and productivity in a 10-l fermentor with 0.5 mol l⁻¹ NaCl were 6.9 g l⁻¹ and 7.9 g l⁻¹ d⁻¹, respectively. These findings show that Halomonas salina DSM 5928 efficiently produces ectoine at relatively low NaCl concentration. This research also indicates the potential application of free or immobilized cells for continuous culture to produce ectoine.     

Isolation and characterization of a human neutrophil aggregation defective mutant of Fusobacterium nucleatum

Fusobacterium nucleatum is known to adhere to human polymorphonuclear neutrophils (PMNs) and cause them to aggregate. In this study, we isolated a spontaneously occurring aggregation defective (AGG(-)) mutant and this mutant will be used for future study of the interactions between this bacterium and human PMN. Genomic DNA fingerprinting by random-primed polymerase chain reaction method revealed a difference between the parent strain and the AGG(-) mutant. This mutant also showed an altered phenotype in both microbicidal and phagocytic assays, suggesting that the bacterial factor involved in the aggregation may also be very important for the phagocytosis and, subsequently, the killing by human PMNs. Further study of this mutant may help to clarify the molecular mechanisms of the interaction between this pathogen and human PMNs.     

Construction and characterization of an NaCl-sensitive mutant of Halomonas elongata impaired in ectoine biosynthesis

Using transposon mutagenesis we generated a salt-sensitive mutant of the halophilic eubacterium Halomonas elongata impaired in the biosynthesis of the compatible solute ectoine. HPLC determinations of the cytoplasmic solute content showed the accumulation of a biosynthetic precursor of ectoine, l-2,4-diaminobutyric acid. Ectoine and hydroxyectoine were not detectable. This mutant failed to grow in minimal medium with NaCl concentrations exceeding 4%. However, when supplemented with organic osmolytes, the ability to grow in high-salinity medium (15% and higher) was regained. We cloned and sequenced the regions flanking the transposon insertion in the H. elongata chromosome. Sequence comparisons with known proteins revealed significant similarity of the mutated gene to the l-2,4-diaminobutyric acid acetyltransferase from the ectoine biosynthetic pathway in Marinococcus halophilus. Analysis of a PCR product demonstrated that the ectoine biosynthetic genes (ectABC) follow the same order as in M. halophilus.     

单核细胞增生性李斯特菌prfA基因缺失株的构建及其生物学特性

【目的】单核细胞增生性李斯特菌(Lm)是人兽共患李斯特菌病的病原菌,其致病性与调控因子PrfA蛋白作用下毒力基因的表达有着密切关系,本文初步探讨了PrfA蛋白对细菌毒力因子的调控作用。【方法】利用同源重组技术对血清型分别为1/2a和4b的LM4、F4636进行prfA基因的敲除,并构建其回复突变株,对获得的突变株LM4ΔprfA、F4636ΔprfA进行生物学特性研究。【结果】实验结果表明:两株缺失株的溶血活性丧失、回复突变株的溶血活性得到恢复,突变株还丧失磷脂酶活性,黏附和侵袭特性显著下降(P<0.05),对BALB/c小鼠的半数致死剂量提高了105个数量级。【结论】由此表明,PrfA蛋白对hly、plcB、inl家族基因的表达及细菌毒力具有重要的调控作用。prfA基因缺失株的构建为进一步研究PrfA蛋白的调控功能提供了材料,为研究其在Lm致病性中的作用奠定了基础。     

利用Red同源重组技术构建产L-苏氨酸的基因工程菌

利用Red重组技术构建不同基因突变的L-苏氨酸工程菌大肠杆菌ITHR,研究单敲除metA、ilvA和双敲除metA、ilvA基因后对L-苏氨酸积累的影响。应用质粒pKD46介导的Red同源重组系统,通过第一次同源重组将拟敲除基因替换为氯霉素抗性基因,再通过重组酶在FRT位点发生第二次同源重组,消除抗性基因,成功敲除了菌株ITHR体内苏氨酸合成的代谢旁路途径中的metA和ilvA基因,构建了三株不同的基因突变株。将携带苏氨酸操纵子的工程质粒pWYE065电转化入敲除不同基因的突变株中,构建基因工程菌。经5 L发酵罐发酵产酸实验,未敲除任何基因的菌株ITHR/pWYE065 L-苏氨酸的产量为5.55±0.51 g/L,metA基因单敲除菌株ITHR△metA/pWYE065 L-苏氨酸产量为9.77±1.83 g/L,ilvA基因单敲除菌株ITHR△ilvA/pWYE065 L-苏氨酸产量为8.65±1.42 g/L,同时敲除ilvA和metA基因的菌株ITHR△metA△ilvA/pWYE065 L-苏氨酸的产量增加到13.6±1.14 g/L。通过敲除L-苏氨酸的旁路代谢途径中的关键酶的基因,可以增强L 苏氨酸积累的效果,为L-苏氨酸工程菌的进一步改造奠定了基础。     

产单核细胞李斯特菌actA/plcB缺失株的构建及其生物学特性

产单核细胞李斯特菌的毒力因子与该菌在细胞间扩散、传播有着直接的关系,其中肌动蛋白聚集因子ActA是细菌由细胞浆扩散至相邻细胞所必须的因子,而广谱磷脂酶C则参与具有双层膜吞噬体的裂解过程.[方法]本研究中利用同源重组技术成功构建了毒力因子ActA和PC-PLC双缺失的突变株,[目的]并对突变株的毒力和免疫应答潜能进行评价.[结果]Western blot和磷脂酶活性测定实验,分别从蛋白质水平上证实actA和plcB基因的缺失.突变株的毒力显著降低,对小鼠半数致死剂量比野生型菌株提高约10 3倍,但仍然保持较好地诱导T细胞应答的能力,并且能完全保护野生型细菌致死剂量的攻击.实验结果不仅表明ActA和PC-PLC是产单核细胞李斯特菌的重要毒力因子,而且证实安全性提高的突变株依然保持有较强地诱导细胞免疫应答的能力.[结论]因此,该突变株的获得不仅对李斯特菌病的预防具有重要作用,而且为构建预防人类和动物疫病的疫苗载体奠定了基础,此外对于阐明LM毒力因子的致病机理与免疫保护作用提供了条件.     

relA基因在重组大肠杆菌Bk21合成嘌呤核苷磷酸化酶作用研究

利用Red同源重组技术敲除大肠杆菌BL21中relA基因,获得ArelA突变株。进一步研究表明在LB复合培养中reIA基因对大肠杆菌的生长几乎没有明显影响,但是对其重组蛋白的合成有着较大的影响：降低了25％。结果表明,relA基因在大肠杆菌表达重组蛋白方面有着较重要的作用。     

Siderophore production of a periplasmic transport binding protein kinase gene defective mutant of Magnetospirillum magneticum AMB-1

A non-magnetic mutant, NMA61, of the magnetic bacterium Magnetospirillum magneticum AMB-1 was generated by transposon mutagenesis to identify genes involved in magnetosome synthesis. The genomic region of NMA61 interrupted by a Mini-Tn5 transposon was analyzed. The transposon was inserted in an open reading frame (ORF) coding for a periplasmic transport binding protein kinase gene homologue. Three adjacent ORFs and a promoter were identified upstream, indicating that the sequences comprised an operon. Phenotype characterizations showed that the growth inhibition imposed by the exogenous non-assimilable iron chelator nitrilotriacetate was relieved in wild type but not in NMA61, by the addition of the isolated wild type siderophore. Higher concentration of siderophores accumulated in the culture medium of NMA61 than in wild type. These data suggest that the interrupted periplasmic transport binding protein kinase gene homologue is required for siderophore transport into M. magneticum AMB-1.     

EHEC O157:H7 z3276基因缺失株构建及其生物学特性

【目的】肠出血性大肠杆菌O157:H7是世界范围内重要的动物源性致病菌之一,可感染人。I型菌毛是多种致病性大肠杆菌(如肾盂肾炎型大肠杆菌等)可表达的一种黏附结构,与细菌吸附黏膜表面密切相关。然而,O157:H7 fim操纵子上几个核苷酸的缺失却导致其不能表达I型菌毛。BLAST比对结果表明O157:H7独有的开放阅读框z3276编码的氨基酸序列与其他大肠杆菌I型菌毛高度同源,这可能是对O157:H7不能表达I型菌毛的补偿机制,但确切功能尚不清楚。本文探究z3276基因的生物学功能。【方法】利用O157:H7 86-24参考菌株构建z3276基因缺失株(?z3276),并构建其互补株(C?z3276),进而比较亲本株、?z3276与C?z3276的生物学特性及对小鼠致病性差异。【结果】与亲本株相比,?z3276进入对数生长期的时间延后,在半固体琼脂平板上的迁移直径明显缩小,生物被膜形成能力显著减弱。?z3276对HEp-2细胞的黏附和侵袭能力并无明显变化,但对IPEC-J2细胞的侵袭能力明显减弱。在小鼠攻毒试验中,?z3276组排菌数量减少、排菌持续时间缩短。C?z3276各项特性均能回复到与亲本株一致的水平。【结论】z3276基因可能是O157:H7重要的毒力相关因子。     

启动子工程改造大肠杆菌K4生产果糖软骨素

为了进一步提高大肠杆菌K4发酵生产果糖软骨素(K4CPS)的产量,将合成基因簇region 3启动子(PR3)3'端非翻译区(UTR)进行缺失突变,研究其对突变菌株K4CPS合成的影响。研究表明:在ops序列(RfaH蛋白结合位点)存在时,PR3启动子强度和K4CPS产量与UTR的长度变化无关;但ops序列缺失时,UTR的延长可导致PR3启动子的强度和K4CPS产量均低于对照菌株;反之,UTR的缩短能显著提高PR3启动子的强度,进而使K4CPS产量比原菌增加了46%,达到751 mg/L。