人DNAJB6蛋白与人巨细胞病毒皮层蛋白pUL23相互作用的鉴定

pUL23是人巨细胞病毒（HCMV）UL23基因编码的皮层蛋白. HCMV皮层蛋白与病毒颗粒的形成、病毒转移、免疫调控等病毒生活过程相关.利用GAL4 酵母双杂交系统筛选人胚肾cDNA文库,获得与人巨细胞病毒皮层蛋白pUL23相互作用的宿主蛋白分子DNAJB6 ［DnaJ (Hsp40) homolog, subfamily B, member 6］.回复酵母双杂交、体外GST-Pull down和免疫共沉淀试验再次确认两者之间的相互作用.该结果为进一步研究pUL23蛋白在HCMV生活周期中的作用机制提供依据.     

酵母双杂交系统筛选与组蛋白去乙酰化酶1相互作用的蛋白质

目的：获得组蛋白去乙酰化酶1（HDAC1）的cDNA并构建为酵母双杂交系统中的饵基因,筛选出与其相互作用的蛋白质。方法：利用RT-PCR方法从人HeLa细胞中克隆出1446bp的cDNA片段,重组入载体pGBKT7得到pGBKT7-HDAC1,转化至酵母菌AH109,检测其对酵母细胞无毒性也无自激活报告基因活性,然后将其与已转入HeLa细胞基因组cDNA文库的酵母菌融合,进行筛选和验证工作。结果：筛选出3个阳性克隆,经免疫共沉淀试验进一步验证,发现仅有1个蛋白能与HDAC1发生相互作用,测序结果表明该蛋白为FHL2。结论：应用酵母双杂交方法筛选出HDAC1的相互作用蛋白FHL2,为进一步研究HDAC1的作用提供了新线索。     

肿瘤及胚胎组织特异表达蛋白CEP65相互作用蛋白的筛选与鉴定

CEP65蛋白(cancer and embryo expression protein 65)为肿瘤单克隆抗体3H11所识别的抗原分子, RT-PCR及RNA印迹检测表明, CEP65蛋白表达于肿瘤及胚胎组织.为了研究CEP65在肿瘤发生中的作用机制,以CEP65为诱饵蛋白,通过酵母双杂交体系筛选人胚胎组织cDNA表达文库. 从5.2×10⁶个克隆中筛选得到14个阳性克隆,并在酵母体系中通过不同方法得到验证.在此基础上,选取在双杂交中作用明显的51号克隆,与CEP65作GST pull-down实验, 结果证明, CEP65与51号阳性克隆蛋白确能相互作用. 生物信息学分析发现, CEP65与51号阳性克隆蛋白相互作用, 可能通过WW结构域或者蛋白激酶C对细胞的增殖与分化起到调节作用.     

组蛋白酵母双杂交诱饵载体的构建及其自激活作用检测

目的:构建组蛋白 H2A、H2B、H3、H4的酵母双杂交诱饵载体,检测其在酵母细胞中的表达和自激活活性,为应用酵母双杂交系统筛选与组蛋白相互作用的蛋白奠定基础.方法:扩增 H2A、H2B、H3、H4蛋白基编码区 cDNA序列,克隆至酵母表达载体 pGBK-T7中,再将其转化至酵母细胞 AH109中,提取酵母总蛋白,检测各种组蛋白的表达,并检测表达的组蛋白在酵母细胞中对报告基有无自激活作用.结果:将 H2A、H2B、H3、H4基的 cDNA 克隆至酵母表达载体 pGBK-T7中,其中组蛋白 H4得到正确表达,且对报告基 LacZ、HIS3、Ade 无激活作用.结论:可以利用酵母双杂交系统筛选与 H4相互作用的蛋白质.     

人PIRH2b与ARF4相互作用的初步研究

目的 利用酵母双杂交技术筛选PIRH2b的相互作用蛋白。方法 以PIRH2b为诱饵蛋白,利用酵母双杂交技术筛选人胎肝cDNA文库,用GST—pull down验证PIRH2b与ARF4在体外的相互作用,并用绿色荧光蛋白标记PIRH2b,红色荧光蛋白标记ARF4,观察两者在肝癌细胞株Hep3B中的亚细胞定位。结果利用酵母双杂交筛选到一个能与PIRH2b相互作用的蛋白ARF4,GST—pull down验证了两者在体外的相互作用,荧光标记共定位结果显示两个蛋白共定位于Hep3B细胞的核周区域。结论首次发现并证实了PIRH2b与ARF4的相互作用,PIRH2b对ARF4的功能可能有重要影响。     

角质细胞生长因子-2与核糖体蛋白L22相互作用的发现及在哺乳动物细胞中的验证

通过聚合酶链式反应从人胎肝cDNA文库中钓取KGF-2 cDNA,构建诱饵蛋白载体pAS2-1-KGF-2并对其自身转录激活活性进行鉴定,利用酵母双杂交系统筛选人胎肝cDNA文库,挑选双阳性克隆.DNA序列分析和同源检索显示,所获侯选蛋白为人核糖体蛋白L22(RPL22).将KGF-2和侯选蛋白分别克隆至哺乳动物细胞双杂交的BD、AD质粒中,共同转染COS-7细胞,通过CAT分析验证了KGF-2和侯选蛋白之间的相互作用.为阐明KGF-2作用的分子机制提供有益线索.     

酵母双杂交筛选心脏cDNA文库中与人热激蛋白70相互作用的蛋白质

目的:利用酵母双杂交系统从人心肌cDNA文库中筛选与热激蛋白70(HSP70)相互作用的蛋白质。方法:从人心脏cDNA文库扩增Hsp70基因,克隆于pGBKT7载体上,酶切鉴定及序列分析,并检测pGBKT7-Hsp70酵母细胞AH109中的自激活活性;将构建的酵母表达诱饵质粒载体pGBKT7-Hsp70转化AH109酵母细胞,与转化有人心脏cDNA文库的酵母Yl87进行交配实验,筛选与HSP70相互作用的蛋白质,通过一对一的回复杂交实验排除假阳性,对阳性克隆进行序列测定和生物信息学分析。结果:构建了"诱饵"质粒栽体pGBKT7-Hsp70,并证明其在酵母双杂交系统中无自激活活性,筛选得到多个与Hsp70相互作用的阳性转化子,并最终得到HSP70的1个相互作用蛋白质HIP。结论:应用酵母双杂交系统筛选出与HSP70相互作用的1个蛋白质,它们的相互作用可能与HSP70发挥细胞分子伴侣作用有关。     

利用酵母双杂交技术筛选人PROKR2蛋白C端相互作用蛋白

目的:利用酵母双杂交技术从人c DNA文库中筛选人前动力蛋白受体2(hPROKR2)C端相互作用蛋白。方法:复苏酵母菌Y2HGold-hPROKR2-C,与人c DNA文库杂交,计算杂交效率;筛选相互作用克隆并测序,寻找hPROKR2蛋白C端相互作用蛋白;通过在DDO/X、QDO/A/X平皿上划线,对筛选到的人c DNA文库质粒的自活性进行验证;采用GST pull down进一步验证两者之间的相互作用。结果:酵母双杂交实验的杂交融合效率为1.375×10~8;在人cDNA文库中筛选出hPROKR2蛋白C端相互作用蛋白SNAPIN,GST pull down实验证实两者之间存在相互作用。结论:SNAPIN可与hPROKR2蛋白C端结合。     

人肝细胞内戊型肝炎病毒结合蛋白的酵母双杂交筛选

为进一步深入研究戊型肝炎病毒(HEV)感染机制以及致病机理,用酵母双杂交系统从人肝细胞cDNA文库中筛选与戊型肝炎病毒衣壳蛋白E2相互作用的蛋白,核酸序列分析及同源性检索表明,4个克隆与E2相互作用,其中一个克隆与P38IP高度同源,细胞免疫共沉淀实验结果显示:在哺乳动物细胞水平仍能够检测到E2与P38IP片段的特异的相互作用。     

从非同源蛋白质的一级序列预测其结构类

对基于氨基酸组成、自相关函数和自协方差函数提取特征的蛋白质结构类预测算法进行分析比较,对氨基酸组成和自相关函数相结合的方法,以及氨基酸组成和自协放差函数相结合的方法的预测算法进行了研究。结果表明：对非同源蛋白质,因氨基酸和自相关函数相结合的方法中,采用Miyazawa和Jernigan的疏水值时,训练的自检验的总精度为95．34％,其Jackknife检验的总精度为81．92％,检验加的他检验的总精工为86．61％。在氨基酸组成和自协方差函数相结合的方法中,采用Wold等的疏水值时,训练库的自检验的总精度为96．71％,其Jackknife检验的总精度为82．18％,检验加的他检验的总精工为86．88％。这说明氨基酸组成和自相关函数相结合的方法,以及氨基酸组成和自协方差函数相结合的方法可有效提高结构类预测精度,表明提取更多有效的序列信息是提高分类精度的关键。     

DEVELOPMENT OF GENETICALLY ENCODED FLUORESCENT PROTEIN CONSTRUCTS OF HYPERTHERMOPHILIC MALTOSE-BINDING PROTEIN

Circularly permuted green fluorescent protein (cGFP) was inserted into the hyperthermophilic maltose binding protein at two different locations. cGFP was inserted between amino acid residues 206 and 207, or fused to the N-terminal of maltose binding protein from Thermotoga maritima. The cloned DNA constructs were expressed in Escherichia coli cells, and purified by metal chelate affinity chromatography. Conformational change upon ligand binding was monitored by the increase in fluorescence intensity. Both of the fusion proteins developed significant fluorescence change at 0.5 mM maltose concentration, whereas their maltose binding affinities and optimum incubation times were different. Fluorescent biosensors based on mesophilic maltose binding proteins have been described in the literature, but there is a growing interest in biosensors based on thermostable proteins. Therefore, the developed protein constructs could be models for thermophilic protein-based fluorescent biosensors.     

蛋白质骨架库的构建及其在功能蛋白质设计中的应用

利用活性位点嫁接设计新的功能蛋白质的方法需要功能模体和蛋白质骨架两种构件。出于活性位点嫁接的需要,我们构建了一个蛋白质骨架库,且提供搜索与功能模体相配骨架的工具及其评估方法。并用两个活性位点的嫁接进行了检验。     

优质蛋白玉米胚乳贮存蛋白积累的电泳分析

玉米胚乳的２２ ｋＤ和２０ ｋＤ醇溶蛋白在授粉后１５ 天开始积累,编码２２ ｋＤ 和２０ ｋＤ醇溶蛋白的结构基因在胚乳发育过程中同时表达。优质蛋白玉米和ｏ２ 玉米的胚乳中,２２ ｋＤ和２０ ｋＤ醇溶蛋白的合成受到抑制,即ｏ２ 基因对２２ ｋＤ和２０ ｋＤ醇溶蛋白的合成有负的调节作用。Ｍｏ１７／ｏ２ 和Ｍｏ１７ 胚乳醇溶蛋白的双向电泳结果表明,Ｍｏ１７／ｏ２ 的２７ ｋＤ、２２ ｋＤ、２０ ＫＤ和１５ ｋＤ醇溶蛋白的合成均受到强烈的抑制。遗系０４１／ｏ２ 和遗系０４０／ｏ２ 胚乳醇溶蛋白的双向电泳结果表明,二者只在高分子量的蛋白质斑点区域有一些细微的差别。可溶性蛋白的ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析表明,Ｍｏ１７／ｏ２ 胚乳的可溶性蛋白比其同型系Ｍｏ１７ 少３８．７ ｋＤ 和２６．７ ｋＤ两条谱带,多２７．２ ｋＤ和２６．１ ｋＤ两条谱带。二者出现的可溶性蛋白的差异是ｏ２ 基因调控的结果。遗系０４１／ｏ２ 胚乳的可溶性蛋白比其同型系０４０／ｏ２ 多１８．６ ｋＤ和１７．６ ｋＤ两条谱带,少４０．２ ｋＤ 一条谱带,这与ｏ２ 基因修饰因子的作用密切关联